??在心血管疾病研究與藥物評價領(lǐng)域，原代心肌細胞始終是最具生理相關(guān)性的體外模型之一。相比于永生化細胞系，原代細胞能夠更真實地反映心肌細胞的收縮功能、鈣信號變化及力學特性，因此在功能性研究中具有不可替代的優(yōu)勢。

??在HCells多模態(tài)功能檢測實驗中，無論是牽引力、鈣瞬變還是肌節(jié)運動分析，均依賴于細胞具備良好的結(jié)構(gòu)完整性和功能活性。其中，原代大鼠乳鼠心肌細胞（Neonatal Rat Cardiomyocytes, NRCMs）因其獲取相對穩(wěn)定、成活率高、易培養(yǎng)等特點，成為常用模型。

??本實驗的主要目的在于：

• 建立穩(wěn)定、可重復的NRCM分離流程

• 獲得高純度、高活性的原代心肌細胞

• 為后續(xù)HCells功能檢測實驗提供可靠的細胞基礎(chǔ)

HCells-Protocol

??4.1 心臟取材與預處理

將乳鼠在75%乙醇中短暫浸泡消毒后開胸取心，迅速轉(zhuǎn)移至預冷PBS中清洗血液及雜質(zhì)。在冰上使用剪刀將心臟組織盡量剪碎，以增加后續(xù)消化效率。

??4.2 組織消化

將組織塊短暫離心后棄上清，加入預先配制并過濾的復合消化酶液（0.1%胰蛋白酶 + 0.08%膠原酶II）進行重懸。

在37°C水浴中結(jié)合磁力攪拌進行動態(tài)消化，每次約6分鐘。

??4.3 分段收集與消化終止

每輪消化結(jié)束后，收集上清液并轉(zhuǎn)移至含10% FBS的培養(yǎng)基中，以終止酶反應。

向剩余組織塊中補加新鮮酶液，重復上述步驟約6次，直至組織基本完全解離 。

??4.4 過濾與離心

將所有消化液合并，經(jīng)70 μm細胞篩過濾去除未消化組織。

隨后在4°C條件下以300 × g離心5分鐘，收集細胞沉淀 。

??4.5 重懸與差速貼壁

棄去上清后，使用完全培養(yǎng)基（DMEM + 10% FBS + 1%雙抗）重懸細胞。

將細胞懸液轉(zhuǎn)入培養(yǎng)皿中，在37°C培養(yǎng)箱中進行30–60分鐘差速貼壁處理，以去除成纖維細胞 。

??4.6 細胞接種與培養(yǎng)

小心收集上清（富含心肌細胞），進行細胞計數(shù)后按實驗需求接種。

常規(guī)培養(yǎng)約48小時，使細胞完成貼壁并恢復功能狀態(tài)后，即可用于后續(xù)實驗。

??低溫操作至關(guān)重要：取材及剪碎過程需全程冰上操作，以降低細胞損傷

??消化時間控制：單次消化時間不宜過長，避免酶對細胞膜的破壞

??及時終止消化：每輪消化結(jié)束后需立即加入含血清培養(yǎng)基

??差速貼壁時間控制：時間過短純度不足，過長則損失心肌細胞

??細胞恢復時間：建議培養(yǎng)≥48小時后再進行功能實驗

??1. 細胞活率低
可能原因：消化時間過長或溫度控制不穩(wěn)定
解決方案：縮短消化時間，確保37°C恒溫

??2. 成纖維細胞污染嚴重
可能原因：差速貼壁時間不足
解決方案：可適當延長差速貼壁時間至1小時；此外，也可在培養(yǎng)過程中加入適量 BrdU，通過抑制成纖維細胞增殖，提高心肌細胞純度

??3. 細胞不收縮或狀態(tài)差
可能原因：細胞未充分恢復或密度不合適
解決方案：延長培養(yǎng)時間，優(yōu)化接種密度

??4. 貼壁不良
可能原因：培養(yǎng)基或基底條件不適
解決方案：優(yōu)化培養(yǎng)條件，必要時使用功能化基底（如圖案化水凝膠細胞培養(yǎng)板）