PlantScreen植物表型成像分析平臺應(yīng)用案例

一、植物表型組學(xué)與PlantScreen植物表型成像分析技術(shù)

自 20 世紀 90 年代初以來，生命科學(xué)領(lǐng)域出現(xiàn)了為引人注目的“組學(xué)”新概念和新學(xué)科，如基因組學(xué)（genomics）、轉(zhuǎn)錄組學(xué)（transcriptomics）、蛋白質(zhì)組學(xué)（proteomics）和代謝組學(xué)（metabolomics）等。伴隨各種組學(xué)的不斷興起和發(fā)展，90年代末，人們提出了表型組（phenome）和表型組學(xué)（phenomics）的概念。2013年Monya Baker在《Nature》發(fā)表文章“THE ‘OMES PUZZLE”將表型組學(xué)稱為“前景光明（Aspiring）”的組學(xué)研究項目[1]。

表型組定義為：在細胞、組織、器官、生物體或種屬水平上表現(xiàn)出的所有表型的組合。表型組學(xué)可定義為一門在基因組水平上系統(tǒng)研究某一生物或細胞在各種不同環(huán)境條件下所有表型的學(xué)科[2]

DNA 芯片技術(shù)的進一步完善，為植物功能基因組學(xué)研究提供契機[3]。而之前植物表型組學(xué)一直缺乏合適的研究儀器，研究者不得不使用傳統(tǒng)方法來獲取表型組學(xué)的海量數(shù)據(jù)。隨著近幾年FluorCam 葉綠素熒光成像技術(shù)、RGB彩色成像分析技術(shù)乃集合了多種表型成像分析技術(shù)和植物自動培養(yǎng)技術(shù)的PlantScreen植物表型成像分析技術(shù)逐漸成熟，直接促進了植物表型組學(xué)的發(fā)展，同時為基因組、蛋白組、代謝組及表型組數(shù)據(jù)進一步整合起來研究提供了新的挑戰(zhàn)和可行性。關(guān)于FluorCam 葉綠素熒光成像技術(shù)與RGB彩色成像分析技術(shù)在表型組學(xué)中的應(yīng)用，請見：

植物表型組學(xué)研究技術(shù)（一）——FluorCam葉綠素熒光成像技術(shù)

植物表型組學(xué)研究技術(shù)（二）——葉綠素熒光成像與 RGB 彩色成像分析系統(tǒng)

PSI公司在功能強大的FluorCam葉綠素熒光成像技術(shù)基礎(chǔ)上，結(jié)合LED植物智能培養(yǎng)、自動化控制系統(tǒng)、植物熱成像分析、植物近紅外成像分析、植物高光譜分析、自動條碼識別管理、RGB 真彩 3D 成像、自動稱重與澆灌系統(tǒng)等多項先進植物表型技術(shù)，開發(fā)出了PlantScreen植物表型成像分析系統(tǒng)。這一大型系統(tǒng)切合國際ZX的植物表型組學(xué)研究，以ZY化的方式實現(xiàn)了擬南芥、小麥、水稻、玉米乃各種其它植物的全方位生理生態(tài)與形態(tài)結(jié)構(gòu)高通量自動成像分析，用于高通量植物表型成像分析測量、植物脅迫響應(yīng)成像分析測量、植物生長分析測量、生態(tài)毒理學(xué)研究、性狀識別及植物生理生態(tài)分析研究等。

表型組學(xué)借助這些高通量的表型分析技術(shù)和平臺與基因組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)、代謝組學(xué)結(jié)合在一起，已成為系統(tǒng)生物學(xué)的主要技術(shù)平臺，應(yīng)用于復(fù)雜的生命系統(tǒng)的研究。目前已經(jīng)裝備PlantScreen植物表型成像分析系統(tǒng)的大學(xué)、科研單位與大型跨國育種公司有：

二、構(gòu)建植物表型組數(shù)據(jù)的基因組與環(huán)境模型

目前，植物生理學(xué)研究已經(jīng)發(fā)展到了在全基因組測序的基礎(chǔ)上，對特定基因型進行高通量的定量表型研究。通過對表型和基因型的對照研究鑒定并預(yù)測可遺傳的性狀。現(xiàn)代技術(shù)的發(fā)展也為科學(xué)家達到這一目標提供了支持。但是現(xiàn)在的挑戰(zhàn)是：1.如何將這些技術(shù)整合起來，建立用于不同植物物種的表型平臺；2.縮小實驗室與野外研究的差距。

澳大利亞國立大學(xué)、澳大利亞聯(lián)邦科學(xué)與工業(yè)研究組織（CSIRO）植物表型組學(xué)中心和PSI公司合作建設(shè)了高通量表型（High throughput phenotyping，HTP）研究平臺[4]。將HTP與全基因組關(guān)聯(lián)研究（genome wide association studies，GWAS）整合起來，有可能會革命性地提高性狀的發(fā)現(xiàn)率和表型的預(yù)測。這一表型平臺即為PlantScreen植物表型成像分析系統(tǒng)。

圖1.（a）多波段LED提高不同的光質(zhì)與光強；（b）量化葉綠素熒光和綠色像素表型；（c）GWAS分析；（d）PSI提供的PlantScreen植物表型成像分析系統(tǒng)[4]

這一套PlantScreen植物表型成像分析系統(tǒng)能進行環(huán)境條件可控的植物培養(yǎng)，并實時進行可見光譜（RGB）成像、熱成像和葉綠素熒光成像分析（也可以增加其他成像分析功能如近紅外成像、高光譜成像）。實時分析增加了實驗分辨率，例如，成像分析設(shè)定可以ZY化改善遺傳相關(guān)性。此外，在關(guān)鍵時間點的成像數(shù)據(jù)可以進一步探索遺傳相關(guān)性，多余的數(shù)據(jù)可以刪除掉從而提高通量（圖1）。

植物結(jié)構(gòu)功能模型（Functional structural plant models，FSPMs，圖2）傳統(tǒng)上用于模擬環(huán)境條件驅(qū)動的植物生理過程是如何控制影響植物反應(yīng)與生長的。通過PlantScreen模擬四季不同的生長條件并實時測量大量的表型數(shù)據(jù)。這些植物生長的表型數(shù)據(jù)與環(huán)境數(shù)據(jù)才能使FSPMs實現(xiàn)參數(shù)化。這在進行大田條件研究之前是極為重要的測試階段。

圖2.（a）植物功能模型，包含環(huán)境因素；（b）結(jié)構(gòu)模型，包含植物株型；兩者用于根據(jù)環(huán)境與遺傳變量預(yù)測植物表型[4]

澳大利亞國立大學(xué)的科學(xué)家希望以后這套系統(tǒng)可以發(fā)展成模塊化、可擴展的設(shè)計方式，從而用于表型組學(xué)研究設(shè)施、小型實驗室和野外實驗站?，F(xiàn)在，PSI公司已經(jīng)可以根據(jù)用戶需求，靈活提供多種型號的表型分析系統(tǒng)，滿足不同條件下的研究工作。這在植物表型組學(xué)研究技術(shù)（一）——FluorCam葉綠素熒光成像技術(shù)與植物表型組學(xué)研究技術(shù)（二）——葉綠素熒光成像與 RGB 彩色成像分析系統(tǒng)中都有詳細介紹。

三、PlantScreen用于植物逆境表型研究

2013年，帕拉茨基大學(xué)即裝備了兩套PlantScreen植物表型成像分析系統(tǒng)（圖3）。

一套為可同時培養(yǎng)1200個擬南芥標準盆的PlantScreen XYZ三維移動成像版植物表型成像分析系統(tǒng)。它的葉綠素熒光成像單元、可見光譜（RGB）成像單元和VIS-NIR高光譜成像單元安裝在機械臂上，可自動移動到要測量的植物上方進行測量。另一套為PlantScreen植物自動傳送版表型成像分析系統(tǒng)，可對640株擬南芥、谷物或其他作物進行表型分析。培養(yǎng)的植物可以經(jīng)過傳送帶運輸?shù)匠上袷疫M行葉綠素熒光成像、可見光譜（RGB）成像單元、熱成像和SWIR高光譜成像分析，同時具備自動稱重與澆灌功能[5]。

圖3. 帕拉茨基大學(xué)的PlantScreen XYZ三維移動成像版與植物自動傳送版表型成像分析系統(tǒng)[5]

PlantScreen使用的表型成像技術(shù)的一大優(yōu)勢就是可以對植物進行生長與生理學(xué)的無損分析。這些技術(shù)主要包括葉綠素熒光成像、可見光譜（RGB）成像、熱成像、VIS-NIR和SWIR高光譜成像技術(shù)等。使用自動化植物表型分析方法的重要應(yīng)用就是研究植物對各種環(huán)境脅迫的響應(yīng)（圖4）。隨著基礎(chǔ)研究和應(yīng)用研究的深入，自動表型成像技術(shù)逐漸成為了植物生長、發(fā)育、環(huán)境響應(yīng)以及分子育種基因型篩選的重要工具[6]。

圖4.運用RGB、高光譜（計算NDVI）和葉綠素熒光成像（計算Φpo）技術(shù)，同時分析受到鹽脅迫的擬南芥與對照組的差異[6]

帕拉茨基大學(xué)的Jan Humplík利用PlantScreen系統(tǒng)研究了兩種不同品種豌豆（Terno和Enduro）在低溫脅迫的表型變化[7]。

他們使用RGB成像測量了7個時間點的總綠色面積、歸一化綠色面積和生長速率的變化（圖5），發(fā)現(xiàn)TER的生長速度要顯著高于END。到第21天，TER的總綠色面積增加了3.5倍，而END只增長了2.5倍。

圖5.TER植株在21天低溫適應(yīng)中的正面RGB成像圖[7]

通過對葉綠素熒光的測量，發(fā)現(xiàn)低溫對TER的Φpo影響不大，但是顯著降低了END的Φpo（圖6）。這也直接說明了END對低溫脅迫更加敏感。

圖6. 21天低溫適應(yīng)后的TER（實心）與END（空心）的Φpo

圖7.傳統(tǒng)熒光儀與PlantScreen熒光成像單元分別測量A）第二片和B）第三片葉片的Φpo；C）通過PlantScreen熒光成像單元獲得的Fv，F(xiàn)m和Φpo彩色熒光成像圖

Humplík還比較了傳統(tǒng)熒光儀與PlantScreen熒光成像單元（使用FluorCam熒光成像技術(shù)）分別測量的數(shù)據(jù)（圖7）。實驗結(jié)果表明這兩者測量的數(shù)據(jù)沒有差異，但是熒光成像技術(shù)既可以自動計算整株植物的熒光參數(shù)，也可以自由選取感興趣的區(qū)域進行計算；同時獲得的彩色熒光成像圖能夠直觀地反映植物不同部位熒光的差異，以及區(qū)分肉眼不能識別的受害組織與健康組織。而且FluorCam葉綠素熒光成像技術(shù)以其高靈敏度，甚可以單獨分析豌豆的細小卷須。因此比起傳統(tǒng)的熒光儀，更加適用于表型研究，尤其是高通量表型研究。

帕拉茨基大學(xué)的研究者在這次實驗里實現(xiàn)了對16棵植株一小時一次的植物地上部生長（通過RGB成像）和光合效率（通過葉綠素熒光成像）的監(jiān)測，從而發(fā)現(xiàn)了這兩個豌豆品種在PSII開放中心數(shù)量、ZD量子產(chǎn)額等對低溫脅迫應(yīng)對策略的不同。通過對葉綠素成像技術(shù)的驗證實驗，這些科學(xué)家確信這一技術(shù)完全可以為其他植物種類的研究提供更為便捷、有效的工具。

參考文獻：

1. Monya Baker, THE ‘OMES PUZZLE, Nature, 2013, 494: 416-419

2. 玉光惠，方宣鈞，表型組學(xué)的概念及植物表型組學(xué)的發(fā)展，分子植物育種，2009，7（4）：639-645

3. AAharoni, OVorst, 2002, DNA microarrays for functionalplant genomics, Plant Mol. Biol., 48(1-2): 99-118

4. Tim Brown, et.al, TraitCapture: genomic and environment modelling of plantphenomic data, Current Opinion in Plant Biology, 2014, 18:73-79

5. Jan Humplík, et.al, High-throughput plant phenntyping facility in Palacky University in Olomouc, International Symposium on Auxins and Cytokinins in Plant Development, 2014

6. Jan Humplík, et.al, Automated phenotyping of plant shoots usingimaging methods for analysis of plant stressresponses – a review, Plant Methods, 2015, 11: 29

7. Jan Humplík, et.al, Automated integrative high-throughputphenotyping of plant shoots: a case studyof the cold-tolerance of pea (Pisum sativum L.), Plant Methods, 2015, 11:20