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使用遠紅外熒光測量細胞內活性氧

來源：美谷分子儀器（上海）有限公司 更新時間：2025-07-03 17:30:18 閱讀量：170
導讀：使用遠紅外熒光測量細胞內活性氧

背景介紹

活性氧（reactive oxygen species, ROS）是含有有氧細胞代謝產生的氧的化學活性分子。這些化學物質參與各種細胞過程，例如信號傳導、穩(wěn)態(tài)和免疫防御。然而，在環(huán)境壓力下，細胞內的 ROS 水平會急劇增加，并導致脂質、蛋白質和核酸的氧化損傷[1]。這些改變會導致各種病理事件，例如男性不育、癌變和許多其他生理狀況[2]。


熒光探針通常用于測量細胞內的 ROS 水平，其中綠色熒光探針最受歡迎。然而，綠色熒光范圍內的檢測和成像可能會受到細胞自發(fā)熒光的影響[3]。使用遠紅外和近紅外（NIR）熒光染料來測量 ROS 水平則避免細胞自發(fā)熒光的干擾。


SpectraMax iD 系列多功能微孔板讀板儀采用專利的超冷卻 PMT 和 4 光柵光路設計，可減少信號背景和雜散光。這些特性為遠紅外熒光檢測提供了寬動態(tài)范圍和靈敏度。


在此，我們演示了如何使用 SpectraMax iD5 微孔板讀板儀通過兩個熒光測定試劑盒測量細胞內 ROS 水平。使用光譜優(yōu)化向導（Spectral Optimization Wizard）功能，我們優(yōu)化了遠紅外分析的激發(fā)波長和發(fā)射波長組合。最后，我們比較了綠色熒光測定和遠紅外熒光測定之間的測定性能。


材料

Cell Meter? Fluorimetric Intracellular Total ROS Activity Assay Kit *Deep Red Fluorescence* (AAT Bioquest cat. #22903)

Cell Meter? Fluorimetric Intracellular Total ROS Activity Assay Kit *Green Fluorescence* (AAT Bioquest cat. #22900)

HEK293 cells (AATC cat. #CRL-1573)

Menadione (Sigma cat. #M9429-25G)

96-well tissue culture-treated, clear bottom, black-walled plates (Greiner cat. #655087)

SpectraMax iD5 Multi-Mode Microplate Reader (Molecular Devices cat. #iD5)


方法

將 HEK293 細胞以每孔 10,000 個細胞接種到幾個經細胞培養(yǎng)處理的 96 孔微孔板中，并讓細胞在 37°C 培養(yǎng)箱中恢復 24 小時。之后，用 2 倍梯度稀釋的甲萘醌處理細胞，濃度從 25 μM 開始，處理 1 小時。處理后，向細胞中加入 Cell Meter Deep Red ROS 檢測試劑或 Cell Meter Green 熒光 ROS 檢測試劑，并將板在 37°C 下孵育 30 分鐘。


由于激發(fā)波長和發(fā)射波長之間很接近，Cell Meter Deep Red ROS 檢測的推薦波長對（658/675）與 SpectraMax iD5 微孔板讀板儀不兼容。在這個實驗中，我們估計了 625/700 波長對以便激發(fā)和發(fā)射光柵帶寬之間有足夠的距離，同時產生充足的熒光信號（圖 1）。


圖 1：遠紅外熒光光譜。Cell Meter Deep Red ROS 分析的激發(fā)和發(fā)射光譜如上所示。紅色虛線表示激發(fā)光譜峰值在 650 nm 處，紅色實線代表發(fā)射光譜峰值在 675 nm 處?；疑幱皸l表示用于進行分析的選定未優(yōu)化波長對，以及它們相關的 15 nm（激發(fā)）和 25 nm（發(fā)射）光柵帶寬


SoftMax Pro 軟件的光譜優(yōu)化向導用于自動計算遠紅外分析的最佳激發(fā)和發(fā)射波長對。此外，“讀取高度優(yōu)化”功能用于確定分析的最佳讀取高度。實驗中使用的波長和 PMT 增益如表 1 所示。數據和圖表是使用 SoftMax Pro Software 生成的。


表 1：檢測的波長和 PMT 設置


結果

甲萘醌通過中斷線粒體電子傳遞鏈的各個部分導致細胞 ROS 積累[4]，因此我們預計細胞內 ROS 水平會隨著甲萘醌濃度的增加而增加。綠色熒光和遠紅外熒光測定試劑盒均產生具有相似 EC50 值的甲萘醌劑量反應曲線（圖 2 和 3）。光譜優(yōu)化向導的遠紅外分析波長組合提供了最佳的 Z' 因子（表 2）。


圖 2：綠色熒光細胞內 ROS 測量。使用 Cell Meter Green 熒光細胞內 ROS 測定法測定甲萘醌處理的 HEK293 細胞，并在 SoftMax Pro 軟件中生成 4 參數劑量反應曲線。根據數據計算出 EC50 為 1.86 μM


圖 3：遠紅外熒光細胞內 ROS 測量。與用戶估計的波長對相比，光譜優(yōu)化向導確定的波長對（淺藍色）產生的分析窗口更大。EC50 值為 2.10 μM 和 2.21 μM，分別由光譜優(yōu)化的波長對和用戶估計的波長對計算得出


表 2：Cell Meter 遠紅測定的劑量反應和 Z' 因子表。從每次檢測中計算的 EC50 值相似，并且每次檢測都顯示 Z' 因子遠高于 0.5，表明檢測是穩(wěn)定的


結論

SpectraMax iD5 多功能微孔板讀板儀與 SoftMax Pro 軟件相結合，是熒光測量細胞內 ROS 水平的出色工具。SoftMax Pro 軟件中的光譜優(yōu)化向導和讀取高度優(yōu)化功能可自動優(yōu)化分析條件以獲得最佳結果。盡管 SpectraMax iD5 讀板儀能夠有效地檢測這兩種檢測，但具有優(yōu)化激發(fā)和發(fā)射波長的遠紅檢測顯示出比基于綠色熒光的檢測略好的 Z' 因子。


目前 Molecular Devices 公司配備光譜優(yōu)化向導（Spectral Optimization Wizard）功能的讀板儀主要包括：SpectraMax iD3，SpectraMax iD5，這兩款讀板儀將分別被新上市的 SpectraMax iD3s 和 SpectraMax iD5e 取代，另外，SpectraMax i3x 以及 SpectraMax Paradigm 的 Tunable Wavelength（TUNE）檢測卡盒也可使用 Spectral Optimization Wizard 功能。


相關產品鏈接：

SpectraMax iD 系列多功能微孔板讀板機


參考文獻

[1]. Hancock, J. T., R. Desikan, and S. J. Neill. "Role of reactive oxygen species in cell signalling pathways." Biochem Soc Trans. (2001) May; 29 (Pt 2): 345-50.

[2]. Ogawa K, Suzuki K, Okutsu M, Yamazaki K, Shinkai S. The association of elevated reactive oxygen species levels from neutrophils with low-grade inflammation in the elderly. Immunity & Ageing: I & A. 2008; 5:13. doi:10.1186/1742-4933-5-13.

[3]. Lin, Michael Z. "Beyond the rainbow: new fluorescent proteins brighten the infrared scene." Nature Methods 8.9 (2011): 726.

[4]. Kolesova, G. M., L. V. Karnaukhova, and L. S. Iaguzhinski?. "Interaction of menadione and duroquinone with Q-cycle during DT-diaphorase function." Biokhimiia (Moscow, Russia) 56.10 (1991): 1779-1786.



關于美谷分子儀器

Molecular Devices 始創(chuàng)于上世紀 80 年代美國硅谷，并在全球設有多個代表處和子公司。2005 年，Molecular Devices 在上海設立了中國代表處，2010 年加入全球科學與技術的創(chuàng)新者丹納赫集團，2011 年正式成立商務公司：美谷分子儀器 (上海) 有限公司。Molecular Devices 以持續(xù)創(chuàng)新、快速高效、高性能的產品及完善的售后服務著稱業(yè)內，我們一直致力于為客戶提供在生命科學研究、制藥及生物治療開發(fā)等領域蛋白和細胞生物學的創(chuàng)新性生物分析解決方案。

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