可靠    創(chuàng)新    同行    發(fā)展

類器官是在體外微型化和簡化的組織模型系統(tǒng)，因其在模擬組織發(fā)育和疾病、個性化醫(yī)學、藥物篩選和細胞療法方面的巨大潛力而備受關注。盡管在培養(yǎng)生理學相關的類器官方面取得了顯著進展，但仍存在一些挑戰(zhàn)，阻礙了其在現(xiàn)實生活中的應用。特別是，自組織生長的高變異性以及有限的實驗和分析訪問限制了類器官系統(tǒng)的可移植性。在這篇綜述中，我們提出，通過在類器官系統(tǒng)各個層面上采用工程學方法，可以解決傳統(tǒng)類器官培養(yǎng)中的許多限制。我們研究了細胞表面和基因工程方法，并討論了基于設計基質(zhì)以實現(xiàn)對類器官生長和形狀的時空控制的干細胞微環(huán)境工程。我們探討了微流體方法和從器官芯片中學到的經(jīng)驗如何使機械生理參數(shù)的整合成為可能，并提高了類器官的可訪問性，以改善功能讀數(shù)。將工程原理應用于類器官可以提高可重復性和提供實驗控制，這最終將有助于實現(xiàn)類器官在臨床上的應用。

我們對干細胞行為的理解取得了重大進展，導致建立了復雜的三維培養(yǎng)系統(tǒng)，被稱為類器官（organoids）（詳見框1）。事實上，給予干細胞一組生化和生物物理信號，模擬體內(nèi)干細胞微環(huán)境，使其能夠保持分化成其來源組織中不同類型的細胞，并在體外培養(yǎng)時不斷自我更新以補充干細胞庫。在這些人工條件下，干細胞不僅可以增殖，還能夠自我組裝成復雜結(jié)構(gòu)。與傳統(tǒng)的二維培養(yǎng)系統(tǒng)相比，三維器官樣體更接近天然器官，在基因和蛋白質(zhì)表達、代謝功能和微觀組織結(jié)構(gòu)方面表現(xiàn)更好。因此，類似于已經(jīng)建立起來的器官芯片系統(tǒng)（詳見框2），器官樣體提供了一個有前景的工具用于推動個性化醫(yī)學和下一代藥物篩選，并且減少對動物實驗的需求。越來越多種類的器官都可以建立相應的樣體模型，包括但不限于腸道、胃、腎臟、肝臟、胰腺、乳腺、前列腺 以及上呼吸道等等；這些模型可以由組織固有成年干 細 胞(ASCs)直接從活檢樣本中獲取 (圖1)，或者由多潛能 干 細 胞(PSCs)，如 胚 胎 干 細 胞(ESCs)或誘導多潛能 干 細 胞(iPSCs)(圖2)，通過重新編程分 化 的 組 狀 類 型而得到。

                                     圖1: 組織來源的類器官。

類器官可以從各種器官的組織樣本中生成。A1AT， α -1抗胰蛋白酶;IBD，炎癥性腸病;SARS-CoV-2，嚴重急性呼吸綜合征冠狀病毒2。

                            圖2: 多能干細胞衍生的類器官

類器官可以由多能干細胞生成，用于多種器官。AD，阿爾茨海默病;ALI，氣液界面;ASD，自閉癥譜系障礙;DKC，先天性角化不良;腸內(nèi)內(nèi)分泌失調(diào);EB，胚狀體;胚胎干細胞;誘導多能干細胞;LCA, Leber先天性黑朦;PD，帕金森病;多囊腎病;RP，視網(wǎng)膜色素變性;呼吸道合胞病毒;寨卡病毒。

在標準的ASC衍生類器官培養(yǎng)系統(tǒng)中，單個干細胞(或小細胞簇)被植入基質(zhì)中，該基質(zhì)模擬細胞通常所處生態(tài)位的基本方面。在針對關鍵調(diào)控途徑的適當信號條件下，細胞經(jīng)歷增殖、分化、遷移和選擇，盡管缺乏空間組織的線索，但它們生長成可以經(jīng)歷對稱破缺的結(jié)構(gòu)，并獲得顯著程度的結(jié)構(gòu)復雜性，在一定程度上反映了其體內(nèi)器官的組織和細胞類型多樣性。ASC衍生的腸道類器官通常首先生長成單層球體，形成隱窩樣突起，使人想起原生組織的腺上皮。在體內(nèi)，隱窩和絨毛沿軸方向形成圖案需要形態(tài)發(fā)生梯度;值得注意的是，腸道類器官在均勻的培養(yǎng)條件下(即沒有任何確定的外部梯度)獲得了類似的細胞類型組織。類器官在與相應器官的結(jié)構(gòu)相似性和功能再現(xiàn)方面進一步超越了二維細胞培養(yǎng)。例如，腸道類器官可以產(chǎn)生粘液，吸收和分泌生物分子，并表現(xiàn)出上皮屏障的完整性。由于干細胞的維持，asc衍生的類器官似乎可以無限擴展，使它們成為不可思議的未轉(zhuǎn)化原代細胞的寶貴來源。

PSC衍生的類器官是很有前途的平臺，用于模擬器官，如大腦，其中組織樣本不容易獲得，并用于模擬器官發(fā)生的發(fā)育過程。與體內(nèi)器官的發(fā)育類似，PSCs生長、分化并最終形成結(jié)構(gòu)和功能與成人器官相似的類器官。例如，生成腦類器官的方案通常從PSC的聚集體開始，這些聚集體形成所謂的胚狀體。在第一個懸浮培養(yǎng)步驟之后，這些胚狀體被嵌入細胞外基質(zhì)(ECM)-富含蛋白質(zhì)的基質(zhì)中，并放置在旋轉(zhuǎn)的生物反應器中，它們在其中生長成具有與各種腦區(qū)域相對應的室室的自組織神經(jīng)上皮結(jié)構(gòu)。然而，這種發(fā)展依賴于分化過程的隨機性，這最終導致了類器官之間的高度異質(zhì)性。為了更好地控制分化過程，開發(fā)了幾種方案，目的是產(chǎn)生特定大腦區(qū)域的類器官;例如，類似大腦皮層、小腦或中腦的腦類器官。此外，中腦類器官的產(chǎn)生也已經(jīng)從分化程度更高的神經(jīng)上皮前體細胞開始，這最終導致了功能更強的類器官。

內(nèi)胚層來源的上皮類器官，如胃腸道和呼吸類器官，也可以由PSCs生成。PSCs可以分化為內(nèi)胚層祖細胞，然后嵌入富含ECM蛋白的基質(zhì)中，在適當?shù)拇碳は鲁墒?，形成與天然器官相似的結(jié)構(gòu)。與ASC衍生的類似物相比，它們也含有間充質(zhì)層，通常更大，但是，一旦建立，它們不容易通過簡單的傳代進行繁殖。

類器官已被證明在基礎研究中的許多應用中是有用的，并為生物醫(yī)學的進步做出了貢獻(圖1、2和框3)。然而，類器官尚未廣泛用于轉(zhuǎn)化研究，如藥物篩選或再生醫(yī)學。類器官被廣泛建議通過使用健康細胞來替代患病組織，從而增強醫(yī)學移植的能力，事實上，在小鼠身上進行的幾項研究證實了這一希望;然而，通往實際應用的道路是漫長的，為了充分利用類器官的潛力，必須克服幾個限制。

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專欄1 類器官系統(tǒng)的歷史

第一個體外器官模型是以癌細胞為基礎的，因為癌細胞是不朽的，很容易維持。然而，由于對癌前基因突變的積極選擇，癌細胞系的分子特征發(fā)生了高度改變。因此，中樞通路，包括細胞周期調(diào)節(jié)基因、生長因子、受體、腫瘤抑制因子和致癌基因，都是失調(diào)的。此外，癌細胞系不能從每個患者樣本中建立，因此，它們不能代表人群中的遺傳變異。此外，這些模型是在二維中培養(yǎng)的，因此缺乏空間組織，無法概括出一整套健康分化的細胞類型。另外，原代外植細胞可用于體外模擬哺乳動物組織。這些培養(yǎng)概括了細胞異質(zhì)性，因此在生理學上更相關。然而，它們?nèi)狈ψ晕腋碌哪芰?，而且它們的培養(yǎng)依賴于新鮮的手術組織，這限制了它們的適用性。

1975年，James Rheinwald和Howard Green開創(chuàng)了類器官的研究領域，他們發(fā)現(xiàn)人原代角質(zhì)細胞和受輻照的小鼠成纖維細胞共同培養(yǎng)可形成層狀自組織鱗狀上皮，細胞分裂局限于基底層，上層存在終末分化的角質(zhì)化細胞，類似于層狀皮膚。這項工作是第一次對未轉(zhuǎn)化的人類細胞進行長期培養(yǎng)。1987年，Mina Bissel小組首次強調(diào)了在三維水凝膠中培養(yǎng)細胞的重要性，他們證明了在細胞外基質(zhì)樣環(huán)境中，原代乳腺上皮細胞向泡狀結(jié)構(gòu)的功能分化和病理狀態(tài)的再現(xiàn)，開創(chuàng)了體外形態(tài)發(fā)生領域。

成體干細胞可以在體內(nèi)產(chǎn)生組織的所有細胞類型，并且它們不斷自我更新以補充干細胞庫。在2009年發(fā)表的一項具有里程碑意義的研究中，Hans Clevers實驗室報道了將單個腸道干細胞植入具有組織樣硬度和必需可溶性生態(tài)位因子的細胞外基質(zhì)替代物中。干細胞增殖并形成復雜的三維組織結(jié)構(gòu)，包含干細胞和各種分化細胞類型，現(xiàn)在被認為是第一個類器官。這些腸道和其他上皮類器官，如胃或肝類器官，自組織成部分類似于原始組織的結(jié)構(gòu)。這些類器官中的干細胞群得以維持，使它們成為未轉(zhuǎn)化細胞的寶貴來源。上皮類器官本質(zhì)上是囊性的，即它們由圍繞中心管腔的封閉結(jié)構(gòu)的單層細胞組成，這使得實驗進入具有挑戰(zhàn)性，并且重新播種的必要性阻礙了長期研究。

由人類多能干細胞(PSCs)發(fā)展而來的類器官，對于無法獲得細胞的工程組織(如大腦或視網(wǎng)膜)尤其有用。PSC衍生的類器官是由Yoshiki Sasai小組首創(chuàng)的，他們通過模擬發(fā)育途徑，在體外從胚胎干細胞中形成皮質(zhì)組織和光學杯狀結(jié)構(gòu)。成體干細胞衍生和PSC衍生的類器官依賴于干細胞及其后代的內(nèi)在能力來自組織和形成三維結(jié)構(gòu)，類似于體內(nèi)組織，這使它們成為藥物篩選和疾病建模的有前途的模型系統(tǒng)。

框2 類器官和器官芯片

芯片上的器官是模擬人體器官的類器官的替代(但補充)方法。類器官依賴于生長的細胞聚集體的自組織，而芯片上的器官則基于還原論的工程方法。器官芯片旨在通過模擬在體內(nèi)執(zhí)行這些功能的組織元素來捕獲特定器官生理功能不可或缺的關鍵功能。因此，芯片上的器官通常包含特定的細胞類型以及體內(nèi)微環(huán)境的關鍵生化和生物物理特性。器官芯片領域的里程碑是由donggeun Huh等人建立的肺芯片器件，該器件隨后被進一步用于模擬其他器官，如腸道和腎臟。這些器件易于讀出，并允許精確控制環(huán)境參數(shù)。此外，芯片上的器官通常是可復制的，與類器官系統(tǒng)相比，它們的壽命更長。然而，它們往往缺乏組織的復雜細胞結(jié)構(gòu)。此外，器官芯片平臺需要復雜的實驗裝置，包括管道、泵和對微加工設備和專業(yè)知識的要求。最后，與類器官相比，細胞系的使用降低了芯片上器官的生理相關性。

專欄3 類器官的應用

類器官廣泛用于模擬和研究組織發(fā)育、體內(nèi)平衡和再生，例如，確定干細胞分化為特定譜系所需的因素或細胞命運程序背后的分子機制。類器官還使必要基因的敲除研究成為可能，由于胚胎致命性，這在體內(nèi)是不可行的。多能干細胞(PSC)衍生的類器官是一個非常寶貴的發(fā)育生物學模型系統(tǒng);例如，通過在單細胞水平上分析人類和非人類靈長類動物的腦類器官，發(fā)現(xiàn)了神經(jīng)發(fā)育過程中人類特有的特征。

在小鼠中建立疾病模型與技術和倫理挑戰(zhàn)有關，并且小鼠細胞往往不能概括人類病理的所有方面?；蛘?，人類類器官也可以應用;例如，促癌基因可以在胃腸道類器官、肝臟類器官、胰腺類器官或乳腺類器官中發(fā)生突變，以研究癌癥中獲得性突變與生長因子依賴性之間的關系。對于許多神經(jīng)系統(tǒng)疾病，包括阿爾茨海默病(AD)、帕金森病(PD)和自閉癥譜系障礙，缺乏準確的動物模型。腦類器官是研究這些神經(jīng)系統(tǒng)疾病中涉及的細胞和分子過程的一個有價值的模型;例如，在類器官樣3D培養(yǎng)系統(tǒng)中，疾病特異性突變形式β-淀粉樣前體蛋白和早老素-1的過表達允許AD的表型重現(xiàn)，并揭示糖原合成酶激酶3 (GSK-3)的含義。同樣，在富含亮氨酸重復激酶2 (LRRK2)的基因編碼中引入突變，可以從中腦類器官產(chǎn)生PD模型，這概括了PD的關鍵病理特征。該模型帶來了新的機制見解，例如硫氧還蛋白相互作用蛋白(TXNIP)參與LRRK2突變依賴性多巴胺能神經(jīng)元死亡。

類器官也可以從患者的細胞中生成。例如，來自囊性纖維化患者的腸道類器官顯示出異常的氯離子通道功能，可以通過糾正致病突變來挽救。類似地，來自炎癥性腸病(IBD)患者的類器官捕獲疾病的病理生理方面，并提供轉(zhuǎn)錄和甲基化改變的信息。個體患者的疾病表型也可以使用誘導PSC (iPSC)衍生的類器官進行研究;例如，腦類器官已經(jīng)從小頭癥患者或自閉癥譜系障礙患者的iPSCs中產(chǎn)生。值得注意的是，在AD患者ipsc衍生的腦類器官中，在tau過度磷酸化之前觀察到淀粉樣蛋白病理，這揭示了AD表型的爭議。患者特異性ipsc衍生的視網(wǎng)膜類器官允許建模視網(wǎng)膜色素變性和Leber先天性黑朦，有助于建立有效的基因編輯療法所需的知識。多囊腎病患者的腎類器官與健康對照的類器官相比，囊腫形成顯著增加，從而發(fā)現(xiàn)微環(huán)境在多囊腎病中的關鍵作用。事實上，在iPSC類器官中也重現(xiàn)了許多其他病理。

癌癥類器官可以從腫瘤活檢樣本中獲得，包括胃腸道樣本，肝臟樣本，乳房樣本，前列腺樣本和肺部樣本。癌癥類器官捕捉到疾病的異質(zhì)性，因此，為個性化醫(yī)療預測臨床治療結(jié)果提供了一個極好的工具。它們還允許中通量到高通量的治療篩選和藥物毒性評估。

類器官也是感染生物學中有用的模型;例如，上皮類器官可用于研究宿主與微生物的相互作用。胃類器官用于研究幽門螺桿菌感染，腦類器官用于模擬和研究寨卡病毒感染機制。類器官是應對SARS-CoV-2大流行的另一個有價值的研究工具。肺、毛細血管、腎臟和腸道類器官可能被病毒感染，這為了解組織趨向性和復制位點提供了線索。

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當前類器官系統(tǒng)的局限性
有限的成熟度和功能

在腸道(粘液產(chǎn)生和吸收活動)、胃(組胺誘導的酸化)、肝臟(白蛋白表達、糖原積累和低密度脂蛋白攝取)和乳腺類器官(產(chǎn)奶)中已經(jīng)實現(xiàn)了令人印象深刻的生理功能;然而，沒有一個已建立的類器官系統(tǒng)能夠復制其各自器官的全部功能。類器官通常缺乏關鍵的特化細胞類型，由于(部分)缺乏間質(zhì)室、血管化和/或微生物組，不能再現(xiàn)天然器官的復雜性。盡管已經(jīng)建立了多室類器官，但它們?nèi)狈σ恢碌募毎M織，這阻礙了忠實和可靠的實驗讀數(shù)。流動、空氣界面或機械刺激的應用可以改善體外細胞的終末成熟;然而，這些功能的集成在技術上仍然具有挑戰(zhàn)性。類器官系統(tǒng)的一個重要缺點是它們在培養(yǎng)中維持的時間有限。上皮類器官的壽命約為一周，這通常不足以在體內(nèi)將ASCs穩(wěn)健地分化為預期的全套分化細胞類型。這種培養(yǎng)時間限制在psc衍生的類器官中甚至更成問題，它們的壽命與體內(nèi)器官發(fā)生的時間存在巨大差異，特別是在人體系統(tǒng)中。因此，這些類器官通常不能成熟到超過胎兒表型。因此，腦類器官，例如，正在模仿胎兒大腦表型，需要進一步努力加強成熟，以獲得一個忠實的成人大腦模型。

可獲得性

類器官的有限壽命往往是限制可及性的直接后果。隨著類器官的增長，依賴擴散的營養(yǎng)供應和廢物清除變得不那么有效。例如，在囊性上皮類器官中，死細胞積聚在空心腔中，因此，類器官必須破碎并重新播種。大腦類器官可以長到幾毫米大小，缺乏營養(yǎng)會導致內(nèi)核壞死，這只能通過搖動培養(yǎng)物來部分解決。除了營養(yǎng)供應的問題外，難以接近也給控制類器官的不同區(qū)室?guī)砹藛栴}。在上皮類器官中，如腸類器官，實驗通常需要進入上皮的內(nèi)外部。例如，在關注宿主-病原體相互作用的研究中，微生物需要被輸送到類器官的頂端(通常面向管腔)，而代謝物和細胞因子則優(yōu)先從基側(cè)輸送。

非均質(zhì)性

類器官系統(tǒng)在類器官形成效率、終點形態(tài)和功能方面也存在相當大的可變性，這往往是體外自組織和細胞命運選擇的隨機性所固有的。減少這種可變性對于充分利用類器官在疾病建模、藥物篩選和再生醫(yī)學中的潛力至關重要。需要進一步探索工程策略，如提高自動化程度，使用定義的介質(zhì)和基質(zhì)，以及精確的現(xiàn)場評估，以減少類器官發(fā)育的可變性。此外，類器官生長的初始條件有助于類器官變異性，包括起始細胞群，它們的定位和聚集。自動化的一個關鍵限制也是類器官生成方案的復雜性，這通常需要多個實驗步驟，特別是對于psc衍生的類器官。例如，簡化生成背前腦類器官的程序大大提高了可重復性。工程技術——從工程細胞到整個生物體工程——有望增加類器官方案的穩(wěn)健性。

讀出（Readouts）

常規(guī)使用的裝置主要使用光學監(jiān)測作為讀數(shù)，它只能提供關于類器官功能的很少信息。代謝物、分泌肽或電位的原位監(jiān)測受到與類器官形成相關的變異性的挑戰(zhàn)。例如，測量跨上皮電阻為二維跨上皮培養(yǎng)系統(tǒng)評估上皮屏障完整性提供了一種標準技術;然而，在類器官中進行此類測量在技術上具有挑戰(zhàn)性。同樣，肝臟體外系統(tǒng)的功能可以通過分析外源性化合物和內(nèi)源性底物的代謝物，或膽汁和蛋白質(zhì)(如白蛋白或轉(zhuǎn)鐵蛋白)的合成來評估。然而，只有少量的這些分析物通常存在于單個類器官中，這使得它們的分析變得困難。將微型生物傳感器集成到類器官系統(tǒng)中可以解決這個問題，這需要對培養(yǎng)設置進行調(diào)整。事實上，包含許多類器官的典型水凝膠圓頂對于結(jié)合生物傳感器電極是相當不切實際的。分析物的一致測量將需要能夠控制類器官位置和限制類器官形狀的設置。此外，與藥物篩選應用相關的高通量測量需要實現(xiàn)自動化功能測量。

這些問題限制了類器官的可翻譯性，這是它們的設計原則所固有的。因此，僅僅微調(diào)可控參數(shù)(例如，細胞因子和基質(zhì)組成的選擇)可能不足以克服這些限制。類器官系統(tǒng)的設計需要重新評估，以增加可控參數(shù)的數(shù)量。通常通過對芯片上器官技術的概念驗證研究來探索的工程方法，為解決類器官平臺的許多局限性提供了可能性。在這篇綜述中，我們討論了不同尺度的工程策略，包括(亞)細胞行為工程、局部(生態(tài)位)組織工程和創(chuàng)建整個生物體整體模型的工程嘗試。最后，我們研究了讀出類器官功能發(fā)展的新方法，以便更徹底地表征和納入高通量分析管道(圖3)。

                            圖3: 類器官的工程方法

工程方法可以在幾個層面上應用于類器官，包括細胞水平、生態(tài)位水平、多組織水平，并改善功能讀數(shù)。

設計細胞

細胞作為類器官的組成部分，是一個很有前途的操控點。事實上，改變細胞的內(nèi)在特性提供了一個強大的方法來增加類器官的健壯性，并為特定的應用量身定制它們。

表面工程

較差的生長穩(wěn)健性和模式是類器官的主要限制，導致高度異質(zhì)性的終點集合。實際上，初始培養(yǎng)條件決定了細胞(或細胞簇)是否會通過自組織形成類器官。特別是，初始細胞聚集體的大小和形狀是重要的起始條件，由于初始細胞數(shù)量的微小偏差，許多方案失敗?？刂萍毎奂ǔＪ峭ㄟ^微孔結(jié)構(gòu)或微流體裝置來實現(xiàn)的;或者，可以修飾細胞表面，即細胞膜，以改善或啟動細胞聚集。例如，細胞膜可以用特定的附著肽、蛋白質(zhì)、納米顆粒、聚合物或生物正交化學物質(zhì)來修飾，通常是通過生物正交化學連接(例如，使用n -羥基琥珀酰亞胺(NHS)酯、唾液酸、氧胺及其衍生物)、靜電相互作用或脂質(zhì)體遞送。功能化細胞表面(即細胞上的酮或氧胺基團相互結(jié)合)之間的生物正交肟形成反應隨后導致多層微組織(例如，人間充質(zhì)干細胞和成纖維細胞)的形成，其大小和密度受光介導控制。合成DNA片段與細胞表面的結(jié)合也得到了廣泛的探索;例如，用3D DNA折紙納米結(jié)構(gòu)裝飾細胞表面可以實現(xiàn)細胞-細胞粘附的編程。另一種在體外控制細胞空間排列的優(yōu)雅方法是對被膜結(jié)合納米顆粒磁化的細胞施加外部磁場。我們建議，這種表面工程方法也可以應用于類器官領域，以預先組織不同的起始細胞類型，例如，將內(nèi)皮細胞排列在更大的肝細胞簇中，這將允許產(chǎn)生更生理相關和更長壽的血管化肝類器官。

基因工程

除了修飾細胞表面，大量的基因工程策略可用于控制細胞的內(nèi)在特性。在遺傳水平上，細胞可以通過兩種概念上不同的方式進行工程改造:通過靶向控制干細胞分化和/或關鍵生態(tài)位信號的通路成分，或者通過集成受合成生物學啟發(fā)的人工邏輯電路。類器官系統(tǒng)通常缺乏終末分化的細胞類型，這與我們對干細胞命運驅(qū)動因素的理解有限，以及在體外外源的、廣泛應用的信號對體內(nèi)線索的再現(xiàn)較差有關。例如，通過CRISPR-Cas9技術進行的靶向基因組編輯已經(jīng)證明了其在基礎研究和臨床應用方面的巨大潛力，盡管仍然存在對脫靶效應的擔憂。

基因組編輯可以用來修改類器官中細胞對外部刺激的內(nèi)在反應，目的是產(chǎn)生原本不存在的細胞類型。此外，特定分化驅(qū)動因子的誘導表達可以用于促進細胞的終端分化，否則可能只存在于更不成熟的狀態(tài)。例如，細胞色素P450超家族蛋白(CYP3A4)的靶向轉(zhuǎn)錄激活可促進PSC衍生的肝類器官的細胞成熟。相反，基因工程可以用于敲除特定細胞亞群中的相關信號通路，使它們對相應的刺激沒有反應，這可以解決類器官中缺乏空間信號控制的問題。然而，這種有針對性的方法需要了解細胞命運決定背后的調(diào)控網(wǎng)絡，而這些知識通常仍然有限。此外，基因編輯技術是復雜的，基因工程類器官本質(zhì)上不太具有生理相關性，這對于細胞-細胞相互作用和自組織過程的研究尤其不可取。

基因編輯也可以以糾正范式進行，即糾正單個致病突變。例如，基因校正的患者來源類器官可以為自體移植補充病變組織提供來源。類器官的基因校正首先在囊性纖維化患者的腸道類器官上進行。在這里，通過CRISPR-Cas9糾正了CFTR基因中的因果突變，并在福斯克林誘導的腫脹試驗中評估了由此產(chǎn)生的類器官的功能恢復。視網(wǎng)膜類器官來源于色素性視網(wǎng)膜炎患者的iPSCs，也可以通過基因校正來修復光感受器形態(tài)和功能缺陷。盡管這些經(jīng)過基因校正的類器官沒有被移植到動物模型中，但它們展示了將基因編輯技術應用于臨床移植的潛力。此外，在逆向方法中，可以在健康的類器官中設計特定疾病，目的是發(fā)現(xiàn)突變對疾病的因果關系并模擬特定的病理方面。例如，在健康的結(jié)腸直腸類器官中連續(xù)誘導單一基因突變可以模擬癌癥表型。有趣的是，誘導突變的數(shù)量與異種移植的致瘤能力相關。此外，腺瘤性大腸息肉病和p53的缺失足以誘導染色體不穩(wěn)定和非整倍體，這兩者都是癌癥的標志。類似的實驗可以在體外建立各種相關的疾病模型，并突出或確定特定基因?qū)ο忍煨曰颢@得性病理的因果影響。這樣的實驗在二維細胞培養(yǎng)中不具有生理學或病理學相關性，因為效果可能依賴于缺失的細胞類型，類似的動物研究與技術和倫理挑戰(zhàn)有關。

基因組編輯技術不僅可以針對單個基因，還可以整合整個人工遺傳回路。特別是，合成生物學使這種基因回路的工程能夠通過反饋回路產(chǎn)生多細胞邏輯反應和自組織。人工基因電路的整合也將有利于類器官領域，盡管這樣的研究尚未進行。盡管如此，合成生物學方法已被用于簡化細胞系統(tǒng)中的細胞聚集編程。受哺乳動物胚胎發(fā)育過程的啟發(fā)，簡單的圖案形成可以使用圖靈反應擴散系統(tǒng)來設計，該系統(tǒng)由兩個擴散配體Nodal和Lefty組成。由于它們的相互激活和抑制，在其他同質(zhì)細胞群中可以形成特征性的點樣模式。此外，基因工程刺激有可能偏向細胞命運的選擇;例如，轉(zhuǎn)錄因子GATA6表達的脈沖足以啟動iPSCs均質(zhì)集群中的胚層出現(xiàn)和對稱性破壞。

遺傳電路也可以與細胞命運選擇相結(jié)合，例如，在基于notch的工程系統(tǒng)synNotch中。在該系統(tǒng)中，Notch受體的細胞外結(jié)構(gòu)域被改變以識別用戶定義的配體，從而允許對細胞正常Notch信號轉(zhuǎn)導級聯(lián)的輸入進行實驗控制。至關重要的是，synNotch受體的胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域也可以被設計為激活亞細胞信號因子。輸入和輸出可以被控制，例如，用于纖維母細胞到成肌細胞轉(zhuǎn)分化的接觸依賴轉(zhuǎn)錄觸發(fā)。在多組細胞中，synNotch系統(tǒng)也被整合到基于cadherin的細胞-細胞粘附控制回路中(圖4)。一組細胞表達CD19表面配體，第二組細胞表達synNotch受體，以響應CD19(即第一組)，觸發(fā)E-cadherin表達。E-cadherin表達的增加導致細胞聚集，這是由于相互結(jié)合親和力的增加。有趣的是，通過在第一個細胞群中引入第二個synNotch受體，兩個細胞群之間的串擾導致了自分類。聚集的第二種群激活第一種群的相鄰細胞，表達低濃度的e -鈣粘蛋白以及其他基因(即熒光報告基因)。由于細胞-細胞結(jié)合的親和力不同，形成了具有自主對稱性破缺和細胞類型分化的三層自組織結(jié)構(gòu)。該系統(tǒng)還能夠在擾動下再生模式，完美地說明了在多細胞環(huán)境下人工基因網(wǎng)絡的整合，并強調(diào)了基本的形態(tài)發(fā)生可以由純粹的合成生物學方法觸發(fā)。

                        圖4: 引導形態(tài)發(fā)生的工程細胞

當混合在一起時，兩種基因工程細胞自組織成多層組織。顯微鏡圖像顯示，A型細胞(藍色，BFP+)和B型細胞(灰色)混合在一起，通過相互激活和抑制E-cadherin (E-cad)的表達，它們與A型細胞、C型細胞(綠色，GFP+)和D型細胞(粉紅色，mCherry+)發(fā)育成三層結(jié)構(gòu)。首先，在a型細胞存在的情況下，b型細胞轉(zhuǎn)化為c型細胞，由于其高E-cad表達而自我聚集。這些細胞在其表面呈現(xiàn)GFP，反過來，通過激活其合成的抗GFP受體，導致鄰近的a型細胞表達低水平的E-cad和mCherry蛋白，這將導致它們轉(zhuǎn)化為d型細胞。BFP:藍色熒光蛋白;綠色熒光蛋白。

細胞內(nèi)在特性的工程設計肯定會在類器官領域獲得更多的牽引力，不僅用于基礎研究，而且還可以作為精確控制細胞命運的多功能工具箱，甚至可能用于定制形態(tài)發(fā)生。此外，結(jié)合先進技術，如光遺傳學，將有可能擴大邏輯電路的可定制性及其在類器官中的應用，允許精確的時空控制。

潛在市場

自從第一個ASC衍生的類器官建立以來，很明顯，干細胞生態(tài)位的模擬是干細胞在培養(yǎng)中成功自組織生長的關鍵。干細胞生態(tài)位的許多特征，包括ECM、鄰近細胞和它們分泌的信號分子，已經(jīng)被重述;然而，這種各向同性的刺激還不足以培養(yǎng)出與生物醫(yī)學應用中的體內(nèi)器官高度相似的類器官。事實上，類器官培養(yǎng)條件受到有限的細胞反應性和批間可變性的影響。因此，工程仿生平臺提供了更忠實的體內(nèi)生態(tài)位代理，可以改善對細胞生長和分化的控制，從而導致更適合臨床翻譯的生理相關模型系統(tǒng)。

設計矩陣

干細胞生態(tài)位中的ECM是干細胞自我更新和分化的重要參數(shù)，而ECM組成的改變是許多疾病的標志。因此，ECM是幾乎所有類器官培養(yǎng)系統(tǒng)的基礎。Matrigel(或類似的市買產(chǎn)品，如Geltrex)是從Engelbreth-Holm-Swarm小鼠肉瘤中提取的富含層粘膠蛋白的基底膜，是類器官最常用的基質(zhì)，在體外為類器官提供一套復雜的ECM信號輸入和適當?shù)臋C械環(huán)境。然而，Matrigel并沒有很好地定義(這并不奇怪，考慮到它是由近2000種獨特的蛋白質(zhì)組成的)，并且提供有限的定制可能性，阻礙了將其納入定制的基于類器官的檢測。此外，Matrigel是動物源性的，這阻礙了轉(zhuǎn)化為臨床環(huán)境。因此，為了克服這些問題，人們一直在努力生產(chǎn)明確的水凝膠，遵循兩種一般策略:由天然存在的材料例如纖維蛋白、膠原蛋白或透明質(zhì)酸生成的基質(zhì)以及合成水凝膠。

與動物來源的基質(zhì)相比，基于蛋白質(zhì)或多糖的生物聚合物可以重組生產(chǎn)，減少了倫理問題和批次間的可變性?；蛘撸哂泻铣晒羌艿乃z可以用廣泛的生物活性分子修飾，包括ECM分子或ECM片段。例如，與基膜蛋白層粘連蛋白功能化的聚乙二醇(PEG)基水凝膠能夠?qū)崿F(xiàn)可再生的腸道類器官形成。在這些化學定義的水凝膠中，腸道類器官的產(chǎn)生依賴于基質(zhì)降解提供的凝膠隨著時間的推移逐漸軟化。完全合成的生長基質(zhì)可以通過與ECM蛋白的短關鍵氨基酸序列相匹配的肽而不是全長蛋白進行功能化，例如與纖維連接蛋白基序RGD、膠原基序GFOGER和層粘連蛋白基序IKVAV相對應的肽。這種基質(zhì)在支持單個腸道干細胞形成腸道類器官方面取得了一定的成功，然而，它們?nèi)匀徊蝗绾腥L層粘連蛋白的基質(zhì)。然而，PSC衍生的腸道類器官在這種合成基質(zhì)中的生存能力與Matrigel中的生存能力相當。

合成基質(zhì)還提供了實驗解耦類器官生長環(huán)境的剛度、可變性和生物活性的機會，為研究每個參數(shù)對干細胞命運的影響開辟了篩選方法的可能性。此外，合成基質(zhì)可以設計用于特定的類器官應用。事實上，除了更明顯的生物學特征外，物理特性應該被考慮用于3D細胞培養(yǎng)的新基質(zhì)工程。硬度是影響干細胞行為的關鍵生態(tài)位參數(shù)，似乎是間充質(zhì)干細胞向不同譜系分化的關鍵決定因素。因此，用于類器官培養(yǎng)的工程基質(zhì)應該考慮這些物理因素，包括剛度、基質(zhì)粘彈性和可降解性，這些因素必須針對每個特定的類器官系統(tǒng)進行優(yōu)化。原生ECM是高度動態(tài)的、應力松弛的基質(zhì)，其特性可以在化學定義的水凝膠中進行工程設計。特別是，基質(zhì)的應力松弛曲線與它們的粘彈性和粘塑性性能直接相關，最終決定了生長細胞結(jié)構(gòu)(如類器官)的機械約束。為了生成具有定制弛豫特性的生物材料，可以應用動態(tài)聚合物化學，允許共價和弱可逆交聯(lián)共存。這種機械精密的生物材料已經(jīng)在3D細胞培養(yǎng)系統(tǒng)中顯示出令人興奮的結(jié)果。例如，間充質(zhì)干細胞在可調(diào)三維海藻酸鹽水凝膠中的命運被證明高度依賴于基質(zhì)的應力松弛，而與初始彈性模量、細胞粘附配體密度和降解無關。

Shape-guided形態(tài)發(fā)生

在體內(nèi)器官的發(fā)育和穩(wěn)態(tài)過程中，物理邊界對細胞和組織的組織起著關鍵作用。為了在體外提供人工物理邊界等幾何線索，可以使用微制造、3D打印和激光切割等技術。例如，乳腺上皮細胞可以在具有預定義形狀的膠原水凝膠中生長，以概括乳腺上皮小管的分支過程。分支和形成新小管的概率取決于上皮單層誘導的局部幾何形狀。這一過程是由一種自分泌抑制形態(tài)原的擴散所介導的。在腸道類器官中，隱窩樣結(jié)構(gòu)的形成是一個高度隨機的過程，其方向是隨機的，數(shù)量是可變的。微工程支架允許腸道類器官以預先定義的方式進行強大的模式。例如，聚二甲基硅氧烷(PDMS)圖章可以用來制作膠原蛋白支架的圖案，然后將類器官來源的細胞植入支架上。結(jié)合應用類似于在體內(nèi)觀察到的形態(tài)發(fā)生梯度，可以生成與模板的隱窩絨毛結(jié)構(gòu)相匹配的上皮，并具有相應的增殖和分化區(qū)域?；蛘撸梢詰眉す庑螤畹幕|(zhì)將腸道類器官培養(yǎng)成預定的形狀，允許頂端和基部進入，隱窩絨毛樣圖案，最重要的是，長期內(nèi)穩(wěn)態(tài)(圖5)。在這種情況下，類器官被塑造成可進入的管狀結(jié)構(gòu)，隨著時間的推移，可以去除頂部脫落的死細胞。這些“微型腸道”的壽命進一步允許罕見的特化細胞類型的發(fā)展，這在短命的類器官中是不存在的。有趣的是，即使在沒有外部施加的生化梯度的情況下，觀察到的與隱窩和絨毛區(qū)域相似的細胞模式也得以建立，這突出了支架幾何形狀的形態(tài)形成指導潛力。

                              圖5: 類器官工程的優(yōu)勢

腸道類器官生長在有圖案的管狀基質(zhì)中，組織成類似于類器官的隱窩狀結(jié)構(gòu)，遵循預定義的結(jié)構(gòu)。干細胞和祖細胞(粉色，Sox9+)以及Paneth細胞(淺粉色，溶菌酶+)存在于隱窩結(jié)構(gòu)中，而腸細胞(黃色，L-FABP+)則存在于管腔中。集成到微流控裝置中允許長時間的生長。脂肪酸結(jié)合蛋白。

與強迫類器官形成最終形狀不同，支架也可用于引導PSC衍生類器官在其發(fā)育期間(即胚狀體階段)的形狀。例如，在化學定義的微絲支架中生長的類器官采用拉長的形狀，這導致神經(jīng)外胚層的可再生產(chǎn)生，最終，與由球形聚集物產(chǎn)生的標準類器官相比，皮質(zhì)發(fā)育得到改善。將生長中的腦類器官限制在一個薄的圓盤形狀，可以研究驅(qū)動腦褶皺形成的生物物理力量。有趣的是，通過使用LIS1突變的細胞，無腦畸形的關鍵特征可以重現(xiàn)，無腦畸形是一種病理狀態(tài)，顯示大腦中這些褶皺部分缺失。

時空的控制

器官發(fā)生是由干細胞組織自身及其后代的內(nèi)在能力驅(qū)動的。然而，類器官研究表明，干細胞的自組織能力不足以產(chǎn)生功能齊全的成熟器官。在體內(nèi)，組織發(fā)育受到以精確的空間和時間順序提供的外部刺激的影響，這在傳統(tǒng)的3D培養(yǎng)系統(tǒng)中通常無法復制，在傳統(tǒng)的3D培養(yǎng)系統(tǒng)中，細胞被嵌入各向同性基質(zhì)中，并均勻地充滿生化生態(tài)位信號。這一限制可以通過3D培養(yǎng)基質(zhì)來解決，3D培養(yǎng)基質(zhì)可以在時空控制下釋放或呈現(xiàn)生物分子。通過微流控裝置輸送形態(tài)梯度可以進一步誘導可控的對稱性破缺，從而實現(xiàn)可復制的類器官形成。例如，微制造裝置可用于產(chǎn)生穩(wěn)定的SHH激動劑和骨形態(tài)發(fā)生蛋白(BMP)的相對梯度，模擬脊髓發(fā)育過程中椎管神經(jīng)管模式中重要的體內(nèi)形態(tài)發(fā)生梯度。這種基質(zhì)使胚胎干細胞的分化在空間上受到控制，類似于體內(nèi)發(fā)育。SHH也可以通過基因工程人類PSC細胞表達到前腦類器官系統(tǒng)。這些PSCs可以被放置在發(fā)育中的腦類器官的一側(cè)，從而產(chǎn)生形態(tài)梯度，最終導致前腦類器官的背腹狀和前后狀極化。

通過使用工程方法對生長基質(zhì)進行直接圖圖化，也可以實現(xiàn)對生化線索呈現(xiàn)的時空控制，與微流體誘導的梯度相比，這種方法允許更大的宏觀尺度控制。例如，促進細胞遷移和分化的多種生長因子可以通過雙光子光化學在瓊脂糖水凝膠中獨立地空間特異性固定。此外，ECM成分對干細胞的分化有很大的影響;例如，層粘連蛋白和纖維連接蛋白分別促進體外ESCs的心肌細胞和內(nèi)皮細胞分化。同樣，ECM配體組成需求也隨著腸道類器官成熟度的增加而變化。在天然腸道中，隱窩-絨毛軸以ECM蛋白的梯度為模式，并且單個ECM成分在腸道干細胞穩(wěn)態(tài)和分化中發(fā)揮特定作用。因此，生物工程方法，如3D基質(zhì)沉積，可能會進一步改善腸道類器官培養(yǎng)中的隱窩絨毛區(qū)域化或其他類器官系統(tǒng)中類似的對稱性破壞事件，通過預先定義的方式指導模式。

除了空間傳遞的線索，時間控制也可能是必要的，以再生產(chǎn)生具有高水平成熟的類器官。例如，光化學允許設計出響應于光刺激而局部釋放可溶性化學因子(或暴露被掩蓋的化學因子)的基質(zhì)。盡管發(fā)展了各種各樣的光化學，但這些材料在類器官培養(yǎng)中的應用仍未得到充分的探索。在腸道類器官中，光激活的局部形態(tài)因子釋放可能潛在地實現(xiàn)對隱窩樣芽形成的時空控制。同樣，在腸道類器官發(fā)育過程中，ECM的機械性能也在不斷變化，這可以通過引入光介導的合成生長基質(zhì)的機械性能變化來解決，例如，使用光降解水凝膠。同樣，支架的幾何形狀可以隨著時間的推移而改變，以指導新興類器官的形狀，例如，通過依賴光的原位激光消融。

總之，盡管基本生態(tài)位模仿促進了類器官培養(yǎng)系統(tǒng)的產(chǎn)生和維持，但這些類器官在成熟度和功能水平上往往表現(xiàn)出高度異質(zhì)的形狀和隨機變異性。工程基質(zhì)有望在空間和時間上改善對形態(tài)發(fā)生信號的控制，因此，不僅在其組成元素上，而且在其動力學上，提供了模仿組織微環(huán)境的機會。因此，下一代工程材料有望進一步擴大可在體外生長的類器官的數(shù)量，并提高已建立的培養(yǎng)物的發(fā)育穩(wěn)健性。

設計生物體級別的環(huán)境

在體內(nèi)，器官發(fā)生是由細胞生長的直接生態(tài)位刺激調(diào)節(jié)的。然而，器官發(fā)育也受到高階輸入(由周圍組織及其功能提供)以及系統(tǒng)級參數(shù)(如流體流動、機械力或pH值或氧水平的變化)的指導。類器官不容易在整個生物體環(huán)境中整合;然而，這種整合將需要生長生理上相關的穩(wěn)態(tài)器官模型。

可獲得性

類器官，如胃腸道類器官，由于其封閉的囊狀結(jié)構(gòu)和不斷擴張，需要定期分解并重新播種到新的培養(yǎng)物中，這使得它們與長期研究本質(zhì)上不相容。此外，功能原位讀數(shù)和涉及病原體的實驗需要進入類器官的頂端側(cè)。通過應用低通量顯微注射或使用倒置的、由內(nèi)而外的類器官，可以克服類器官的不可接近性;然而，這些策略仍然具有挑戰(zhàn)性，并且效率低下?；蛘?，極化腸和結(jié)腸細胞單層可以在二維可滲透聚合物膜上產(chǎn)生;然而，這種方法排除了三維組織生物學的建模。通過利用工程方法設計一個類器官系統(tǒng)，可以更好地解決難以接近的問題，該系統(tǒng)可以方便地進行實驗并長期維持上皮。例如，微流控裝置是很有前途的工具，可以整合廢物清除和類器官內(nèi)營養(yǎng)供應的通道，并實現(xiàn)對實驗條件的獨立控制。

機械生理參數(shù)的整合

機械參數(shù)，如流量、剪應力、壓力和運動，也對形態(tài)發(fā)生和組織穩(wěn)態(tài)有影響。例如，血流誘導的內(nèi)皮剪切應力觸發(fā)內(nèi)皮細胞的終末成熟。同樣，不同的物理力量參與正常和病理腸道功能。這種組織水平的生物力學刺激在傳統(tǒng)的類器官培養(yǎng)中是缺乏的，在當前的設置中不容易實現(xiàn)。因此，機械生理參數(shù)的結(jié)合要求對類器官的設計原則進行審查，考慮涉及自組織結(jié)構(gòu)及其在允許產(chǎn)生力和運動的設備中的集成的組合方法。

芯片上器官技術引入了許多產(chǎn)生力和維持流體流動的技術;然而，這些系統(tǒng)的相關性經(jīng)常受到質(zhì)疑，因為所使用的細胞系沒有表現(xiàn)出細胞多樣性。利用芯片上的器官裝置，單個胃類器官已經(jīng)在芯片上培養(yǎng)，微移液管可以進入其管腔室，施加管腔流動和壓力循環(huán)，以誘導蠕動樣的運動。雖然這些外部刺激對細胞的影響尚未被研究，但該系統(tǒng)說明了在類器官培養(yǎng)中整合生物物理因素的工程方法的可能性。類似地，腎臟類器官在芯片上生長，并通過施加流體流動暴露在剪切應力下。液體流動的存在不僅促進腎類器官(包括腎小管和腎小球室)的成熟，而且有利于形成具有可灌注管腔的血管網(wǎng)絡(圖6)。

                        圖6:類器官培養(yǎng)的系統(tǒng)環(huán)境工程

在血流誘導的剪切應力下生長的腎類器官顯示出明顯增強的血管化和成熟。共聚焦顯微鏡圖像顯示不同流動條件下的類器官:細胞核(DAPI，藍色)，脈管系統(tǒng)(MCAM，黃色，PECAM1，紅色)和足細胞(PODXL，青色)被染色。DAPI 4’,6-diamidino-2-phenylindole;MCAM，黑色素瘤細胞粘附分子;血小板與內(nèi)皮細胞粘附分子1;podocalyxin樣蛋白。

類似芯片上器官的裝置也允許上皮細胞在二維膜上生長，在頂端和基部都有微流體通道，提供雙邊可達性和施加流體流動的能力。腸道類器官形成細胞，在這種微芯片上播種，生長成具有絨毛樣皺褶的功能性上皮，如果也暴露在模擬腸蠕動和管腔流動的機械拉伸循環(huán)中。這種基于微結(jié)構(gòu)的設備提供了結(jié)合生物物理和生化刺激的機會，從而增加了體外模型的生理相關性及其生成方案的穩(wěn)健性。

多器官系統(tǒng)

許多生理功能和病理狀況不是歸因于一個特定的器官，而是來自多個系統(tǒng)的相互作用。目前的類器官不能模擬更高層次的生物相互作用(例如，組織-組織或多器官相互作用)。芯片上的器官為結(jié)合類器官技術的多器官系統(tǒng)工程奠定了基礎。例如，一種微型制造系統(tǒng)將乳腺癌模型與腸道和肝臟模型結(jié)合起來，模擬抗癌藥物的順序吸收、代謝和靶向生物活性。這種方法已經(jīng)擴展到制造一個13個器官的工程綜合體，稱為“芯片上的身體 body-on-a-chip”，顯示出令人印象深刻的組織活力和基本的生理功能(盡管只有5個細胞系被用作概念驗證)。整合芯片上器官和類器官的協(xié)同方法可以近似天然細胞庫并顯示(病理)生理相關性。例如，在包含胃、腸和肝類器官的基于微流體的三方培養(yǎng)中，可以實現(xiàn)依賴旁分泌信號的膽汁酸產(chǎn)生調(diào)節(jié)，再現(xiàn)生理器官-器官相互作用。類似地，使用生物打印和微工程方法建立了心臟-肺-肝模型，允許器官間的串擾。有趣的是，這一裝置為抗癌藥物的肺依賴性心臟毒性提供了證據(jù)，強調(diào)了多器官方法在藥代動力學篩查中的必要性。

將免疫成分整合到類器官系統(tǒng)中仍未被探索。免疫系統(tǒng)不僅在傳染病中發(fā)揮核心作用，而且在其他病理和正常的體內(nèi)平衡中也起著重要作用。因此，(疾病)模型系統(tǒng)中免疫成分的整合大大提高了它們的相關性。病毒感染(如腦類器官中的寨卡病毒、細菌感染(如胃類器官中的幽門螺桿菌或寄生蟲感染(如腸道類器官中的隱孢子蟲)已在類器官中進行了模擬;然而，由于完全或部分缺乏重要的免疫成分，這些研究可能缺乏相關性。例如，胃幽門螺旋桿菌感染通常會無癥狀地持續(xù)數(shù)十年，最終增加胃潰瘍疾病和胃癌的風險。如此長時間的持續(xù)是由緊密的宿主-微生物相互作用實現(xiàn)的;例如，細菌可以通過干擾T細胞向抗炎調(diào)節(jié)表型的分化來逃避免疫系統(tǒng)。這種免疫逃避機制可以在上皮細胞、細胞毒性T細胞和細菌的三重共培養(yǎng)中進行研究，從而鑒定出幽門螺桿菌誘導的檢查點抑制劑程序性細胞死亡配體1 (PDL1)180的誘導。在IBD等非傳染性疾病中，微生物群、上皮細胞和免疫系統(tǒng)之間的相互作用同樣起著至關重要的作用。因此，類器官是闡明IBD機制的有希望的平臺。例如，含有結(jié)腸類器官衍生的上皮層的平臺可以使用含有膠原的生物工程支架與單核細胞衍生的巨噬細胞作為免疫室進行補充。模擬大腸桿菌誘導的上皮炎癥導致巨噬細胞遷移和促炎細胞因子的產(chǎn)生增加，已知這與IBD有關。在類器官系統(tǒng)內(nèi)長期維持免疫細胞的方案尚未建立;然而，這些開創(chuàng)性的研究強調(diào)了類器官在免疫學研究中的潛力。

綜上所述，研究高級類器官的方法不僅要考慮特定器官的局部生態(tài)位方面，還要考慮系統(tǒng)水平的背景。與傳統(tǒng)的類器官系統(tǒng)相比，系統(tǒng)參數(shù)的近似有望產(chǎn)生壽命更長、表型更成熟、細胞多樣性更高的類器官，并最終具有更高的臨床預測性。這些系統(tǒng)參數(shù)包括生物物理力和菌株，與其他細胞和類器官類型的生化信號，以及營養(yǎng)供應和廢物清除。

提高讀出（readouts）

由于缺乏適當?shù)墓δ茏x數(shù)，使類器官系統(tǒng)的效益最大化受到挑戰(zhàn)。到目前為止，類器官研究主要依賴于表型讀數(shù)(即類器官的外觀，形狀和數(shù)量)(表1)。然而，充分執(zhí)行類器官的承諾將需要集成連續(xù)，準確和多功能的功能讀數(shù)，這些讀數(shù)可以以高通量的方式自動化，以實現(xiàn)基礎研究以外的應用。

                               表1 類器官研究的分析方法

Cfu，菌落形成單位;ECM，細胞外基質(zhì);ELISA，酶聯(lián)免疫吸附試驗;質(zhì)譜法;聚合酶鏈式反應;PTMs，翻譯后修飾;scRNAseq，單細胞RNA測序;Vm、Rm、Cm分別為跨膜電位、電阻、電容;WB, western blot。

基于圖像的分析

光學觀察可能是生物學研究中最古老的技術，也是最強大的分析方法之一。然而，典型的類器官是在3D矩陣中生成的，并且生長在不受控制的位置，這使得自動實時成像具有挑戰(zhàn)性。為了實現(xiàn)活細胞成像，可以通過使用微孔陣列或通過在微流體裝置中捕獲細胞來設計類器官生長位置。例如，腸道類器官可以在聚集后被捕獲在微柱陣列中，以監(jiān)測形態(tài)變化(例如腫脹)。類似地，肝類器官可以在芯片內(nèi)直接生長和分化，以便進行下游分析。然而，盡管形態(tài)學分析提供了一些信息的見解，更直接的證據(jù)關于細胞的分子和功能狀態(tài)將是可取的。例如，基因工程報告細胞系，由于在人類細胞中發(fā)展這類報告細胞系存在技術困難，傳統(tǒng)上主要用于鼠類器官，最近也應用于人類類器官。使用基因組編輯技術，可以在人類類器官中提高產(chǎn)生敲入蛋白(即熒光報告序列)的效率，從而為非侵入性、實時監(jiān)測不同細胞狀態(tài)甚至亞細胞蛋白定位提供了機會。

一些創(chuàng)新的基于成像的策略已被進一步應用于體外生長的類器官的生理參數(shù)測量。例如，連續(xù)磷光壽命成像顯微鏡的O2敏感探針允許跟蹤氧水平，揭示腸道類器官高度不均勻的氧合水平。工程F?rster共振能量轉(zhuǎn)移為基礎的方法也被用于研究細胞內(nèi)蛋白質(zhì)活性(例如，細胞外信號調(diào)節(jié)激酶(ERK))。

原位電化學探測

盡管基于成像的讀數(shù)有巨大的機會，但基本的光學原理挑戰(zhàn)了它們的忠實報告。特別是，類器官具有復雜的3D形狀，并且嵌入在非均勻的矩陣環(huán)境中，這不可避免地會導致光學人工制品。輻射測量方法已被證明可以部分補償偽影，因此比基于強度的方法更好;然而，由于光的散射和吸收是波長相關的現(xiàn)象，它們的精度仍然有限。此外，盡管最近取得了突破，但下游數(shù)據(jù)處理和分析管道的自動化仍然具有挑戰(zhàn)性，這是由于成像參數(shù)往往不均勻，以及感興趣區(qū)域的分割問題反復出現(xiàn)(即目標與背景分離)。相比之下，電化學傳感器提供1D數(shù)據(jù)集，實現(xiàn)簡單，無偏和自動化的下游分析。電化學傳感器的確是準確和通用的，但是它們在類器官培養(yǎng)系統(tǒng)中的廣泛應用受到其體積龐大的性質(zhì)的阻礙，而小型化的傳感器直到最近才被集成在一起。

一種雙器官微流控裝置(包含心臟和肝臟類器官)已經(jīng)配備了多種集成的物理、生化和光學傳感能力(圖7)。除了溫度、氧氣和pH值傳感器外，該裝置還包括微制造的免疫生物傳感器，用于連續(xù)監(jiān)測分泌的可溶性生物標志物。檢測機制基于無標記原理，利用抗原與固定抗體結(jié)合時氧化還原探針電子轉(zhuǎn)移動力學的變化。重要的是，再生過程使傳感器可以在很長一段時間內(nèi)重復使用。此外，所有傳感器都直接連接到一臺處理計算機，該計算機驅(qū)動傳感器和氣動閥進行流體控制，這表明了全自動培養(yǎng)平臺的可能性。

                           圖7: 活體類器官監(jiān)測的微工程平臺

使用微流體裝置可以實現(xiàn)類器官培養(yǎng)物中物理和生物參數(shù)的自動化和連續(xù)原位監(jiān)測。該設備包含多個隔間，用于同時生長不同的類器官，以及用于監(jiān)測各種生物(例如，代謝物和生物標志物)和生物物理(溫度，pH值和氧氣水平)參數(shù)的傳感器。生物傳感器被設計為可再生的，允許連續(xù)測量(插圖)。APAP即對乙酰氨基酚;谷胱甘肽s -轉(zhuǎn)移酶。

一個主要的挑戰(zhàn)是測量超低體積的細胞分泌分析物。事實上，這些數(shù)據(jù)將捕捉細胞的功能狀態(tài)，因此對藥物毒性和藥物篩選分析特別有趣。因此，人們努力將生物傳感器整合到小器官模型系統(tǒng)中。例如，代謝物，如乳酸鹽，離子或蛋白質(zhì)生物標志物，可以使用電化學傳感器進行監(jiān)測。

邁向高吞吐量裝置或器件

對于藥物篩選應用，同時培養(yǎng)和分析大量類器官以增加統(tǒng)計能力并并行篩選數(shù)百到數(shù)千種候選藥物尤為重要。通過結(jié)合成像方法和微加工策略，可以同時分析大量的類器官。微流體平臺還允許按尺寸預先選擇類器官，從而使基線類器官群體均勻化并減少可變性。液滴微流體是一種很有前途的細胞包封技術，但在類器官研究中仍未得到充分開發(fā)。水凝膠膠囊可用于類器官的聚集、生長和操作。例如，嵌入在基質(zhì)珠中的前列腺和乳腺細胞在時間和空間可控的條件下增殖和分化。這種包含封裝細胞的Matrigel珠也以自動化的高通量方式生成。這產(chǎn)生了大量具有均勻大小，組成和細胞分布的微膠囊，并開辟了高通量測量的可能性，如大顆粒流式細胞術。這些微珠易于操作，因此可以控制單個類器官的操作。同樣，分化為內(nèi)胚層、胰腺祖細胞和內(nèi)分泌細胞的人類iPSCs可以被包裹在水凝膠膠囊中，在水凝膠膠囊中，它們以前所未有的一致性形成功能性類器官。這些方法能夠自動生成大量類似的類器官，這是自動化大規(guī)模篩選的必然要求。綜合方法有望極大地促進類器官篩選平臺的發(fā)展，包括藥物發(fā)現(xiàn)的自動化、連續(xù)和功能性讀數(shù)。

結(jié)論與觀點

體外類器官模型可以從各種器官的細胞中獲得，通常在微觀組織結(jié)構(gòu)和細胞多樣性和關鍵功能的再現(xiàn)方面與體內(nèi)同類器官具有驚人的相似之處。然而，最大限度地提高它們的翻譯相關性和適用性仍然存在挑戰(zhàn)。解決這些挑戰(zhàn)需要對類器官的設計原則進行重新概念化。臨床轉(zhuǎn)化的最大障礙之一是類器官的生長環(huán)境不明確，這導致了所產(chǎn)生的類器官表型的高度可變性。事實上，僅僅依靠細胞內(nèi)在的自組織，對細胞命運和形態(tài)發(fā)生的外部控制留下了很少的實驗空間。因此，需要設計的環(huán)境不僅要支持干細胞的維持，還要允許生物活性信號的精確時空調(diào)節(jié)，以指導類器官的生長。例如，水凝膠化學和器官芯片技術可以應用和結(jié)合，以更好地模擬干細胞生態(tài)位，不僅在體內(nèi)生化線索的傳遞和呈現(xiàn)方面，而且通過整合傳統(tǒng)培養(yǎng)系統(tǒng)中缺乏的生物物理和拓撲參數(shù)。

在更基本的層面上，基因工程細胞的行為可以增加類器官的功能相關性，例如，通過調(diào)整對特定實驗刺激的反應或通過驅(qū)動稀有細胞類型的分化。基因工程(誘導)促進細胞分化確實可以繞過體內(nèi)觀察到的漫長的內(nèi)在分化時間尺度。將生物水平的參數(shù)整合到類器官培養(yǎng)物中仍然沒有得到充分的探索。在體內(nèi)，組織對流體流動、力和應變的存在作出反應并共同發(fā)育，并且在相互作用和相互作用的背景下與其他組織和器官相互作用。整合這些系統(tǒng)級參數(shù)將有助于增加類器官的生理相關性，并使體外長期研究成為可能。此外，準確、高通量的功能讀數(shù)與類器官培養(yǎng)本身的優(yōu)化同樣重要。在功能水平上需要對類器官進行精確的表征，否則，將錯過許多微妙的細胞反應，這些反應通常在類器官中沒有立即的形態(tài)學影響，從而排除了臨床相關性。因此，將生物工程策略應用于傳統(tǒng)的類器官培養(yǎng)方案將迎來一個新的類器官發(fā)展時代，并促進其轉(zhuǎn)化為現(xiàn)實應用，實現(xiàn)許多尚未實現(xiàn)的類器官領域的承諾。

復雜程度的問題仍然存在，也就是說，多簡單才足夠復雜。需要為給定的應用程序選擇合適的模型系統(tǒng)，記住復雜性通常是以犧牲實驗控制和吞吐量為代價增加的。類器官比傳統(tǒng)的二維細胞培養(yǎng)更類似生理細節(jié)，但在系統(tǒng)級過程方面不如動物模型。盡管利用工程方法可以使類器官變得更加健壯和具有更強的生理學相關性，但它們可能永遠不會像基于細胞系的模型那樣健壯和可復制，也無法完全再現(xiàn)動物模型的復雜性。因此，為了能夠選擇合適的模型，需要一組具有不同復雜程度的類器官。所需的復雜程度應該與需要建模的過程的規(guī)模相關聯(lián)。例如，細胞過程和均質(zhì)組織的研究不需要復雜的類器官;相比之下，干細胞自組織、大腦發(fā)育或微生物感染的研究需要復雜的類器官來實現(xiàn)精確的實驗控制。通過結(jié)合免疫細胞或間充質(zhì)細胞更準確地模擬器官和相關疾病，可以增加類器官的細胞復雜性。類器官領域在各種背景的研究人員中非常受歡迎，因此，各種協(xié)議正在開發(fā)，其趨勢是為特定應用量身定制更復雜的系統(tǒng)。這些豐富的新方案可能最終導致更優(yōu)越的類器官;然而，標準化將具有挑戰(zhàn)性。因此，需要為單個類器官系統(tǒng)制定指南、質(zhì)量措施和驗證程序。

在這篇綜述中，我們主要討論了類器官系統(tǒng)作為基礎研究和藥物開發(fā)應用的體外模型所面臨的挑戰(zhàn)。然而，類器官也是很有前景的組織工程平臺，這需要在體外構(gòu)建大規(guī)模的組織和器官，以便隨后移植以替代受損或病變的器官。類器官系統(tǒng)還不能滿足工程組織的要求，因為人工制造的器官必須不含動物成分(因此，Matrigel不能使用)，完全安全(沒有致瘤性風險)，并且在厘米到分米的尺度上生長，具有微觀和宏觀控制的結(jié)構(gòu)。此外，工程組織必須表現(xiàn)出生理上相關的組織功能水平。自下而上的組裝方法能夠精確控制細胞沉積在促進生長的基質(zhì)內(nèi)。事實上，類器官和細胞球體已被用作大規(guī)模體外組織工程的構(gòu)建模塊;然而，單一球體和類器官的精確操作直到最近才通過使用生物打印技術和基于微室的方法來實現(xiàn)，例如，通過融合含有心肌細胞和含有心肌成纖維細胞的球體來生長高密度的心臟微組織，或通過融合間充質(zhì)和內(nèi)皮球體來生長成骨組織。為了避免打印具有預制圖案的過于復雜的3D結(jié)構(gòu)，我們最近通過打印具有類器官形成能力的干細胞來形成具有類器官樣微尺度自組織的厘米級多器官結(jié)構(gòu)來尋求一種補充方法。類器官和類器官形成細胞的生物打印仍處于起步階段;然而，它可能為在組織工程中使用類器官打開大門，使功能器官的形成和人工組織的大規(guī)模生長成為可能。


參考文獻
Hofer, M., Lutolf, M.P. Engineering organoids. Nature Reviews Materials, 6, 402–420 (2021). https://doi.org/10.1038/s41578-021-00279-y

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