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2025-02-28 18:17:42抗體文庫構(gòu)建
抗體文庫構(gòu)建是通過聚合酶鏈反應(yīng)等手段，在體外獲取成套抗體可變區(qū)基因，并將其重組入載體，轉(zhuǎn)入適當(dāng)受體細胞或噬菌體中，形成抗體基因克隆集合體。這一過程涉及免疫動物、淋巴細胞提取、mRNA與cDNA合成、基因擴增、構(gòu)建抗體庫、篩選優(yōu)化抗體等多個步驟。構(gòu)建的抗體文庫能表達和篩選出所需單克隆抗體，在生物醫(yī)學(xué)研究和藥物研發(fā)等領(lǐng)域有重要應(yīng)用。

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2025-10-15 17:04:30數(shù)字化轉(zhuǎn)型下，各類實驗室軟件如何構(gòu)建高效合規(guī)的智能生態(tài)？
在數(shù)字化轉(zhuǎn)型浪潮下，實驗室軟件已成為現(xiàn)代實驗室提升運營效率、規(guī)范作業(yè)流程、挖掘數(shù)據(jù)深層價值的核心支撐，不同類型的軟件聚焦特定環(huán)節(jié)痛點，協(xié)同構(gòu)建起覆蓋實驗室全場景的數(shù)字化生態(tài)體系。以下為幾種主流實驗室軟件及其核心功能詳解：?1. King's LIMS（實驗室信息管理系統(tǒng)）?嚴(yán)格遵循 ISO 17025 等國際標(biāo)準(zhǔn)與行業(yè)規(guī)范，構(gòu)建樣品全生命周期的閉環(huán)管理體系。核心功能包括檢驗流程標(biāo)準(zhǔn)化管控、人機料法環(huán)全要素資源管理、合規(guī)性校驗與質(zhì)量風(fēng)險防控，以及檢測報告的自動生成。且系統(tǒng)配備多級數(shù)據(jù)審核機制與深度統(tǒng)計分析能力，確保實驗室運營合規(guī)、高效且數(shù)據(jù)全程可追溯。2. King's ELN（電子實驗記錄本）?以結(jié)構(gòu)化數(shù)字化形式全面替代傳統(tǒng)紙質(zhì)記錄，支持實驗數(shù)據(jù)直接錄入、公式自動計算、實驗步驟與結(jié)果電子化追溯，有效避免紙質(zhì)記錄易丟失、難檢索、易篡改等問題。該系統(tǒng)可與 King's LIMS 無縫集成，實現(xiàn)實驗數(shù)據(jù)與檢驗流程數(shù)據(jù)的互聯(lián)互通，進一步提升實驗室數(shù)據(jù)流轉(zhuǎn)效率。?3. King's SDMS（科學(xué)數(shù)據(jù)管理系統(tǒng)）?專注于實驗室原始數(shù)據(jù)的高效管理，能夠自動采集、精準(zhǔn)存儲各類儀器生成的原始數(shù)據(jù)，支持對結(jié)果數(shù)據(jù)與文件進行分類管理，打破數(shù)據(jù)孤島，為后續(xù)數(shù)據(jù)復(fù)用、深度分析與合規(guī)審計奠定堅實基礎(chǔ)。?4. King's Bl 高性能敏捷分析系統(tǒng)?聚焦實驗室數(shù)據(jù)價值挖掘，可滿足用戶在報表、數(shù)據(jù)可視化、自助探索分析、數(shù)據(jù)挖掘建模、智能分析等方面的多樣化需求，幫助用戶打破信息孤島有效整合數(shù)據(jù)，提供敏捷開發(fā)能力同時快速響應(yīng)業(yè)務(wù)和管理層的數(shù)據(jù)需求，幫助實驗室實現(xiàn)數(shù)字化運營，并全流程支持。?5. King's IOT 實驗室設(shè)備及環(huán)境物聯(lián)監(jiān)控預(yù)警系統(tǒng)?依托物聯(lián)網(wǎng)技術(shù)構(gòu)建實驗室安全與環(huán)境智能管控體系，可實時采集實驗室關(guān)鍵環(huán)境參數(shù)與設(shè)備運行狀態(tài)數(shù)據(jù)，通過穩(wěn)定的無線傳輸硬件將數(shù)據(jù)實時上傳至監(jiān)控平臺。平臺具備數(shù)據(jù)實時顯示、存儲與分析功能，當(dāng)監(jiān)控參數(shù)超出預(yù)設(shè)安全范圍時，可自動觸短信通知等預(yù)警機制，為科研與檢測活動提供穩(wěn)定、安全的環(huán)境保障。 數(shù)字化生態(tài)系統(tǒng)的成功運行，依賴于各模塊之間的深度互聯(lián)與數(shù)據(jù)流的閉環(huán)整合。實驗室藉此構(gòu)建出“可視、可控、可預(yù)測”的數(shù)字孿生體，在合規(guī)、效率與創(chuàng)新之間達成最優(yōu)平衡。上述系統(tǒng)各司其職又緊密協(xié)同，共同構(gòu)建起高效、合規(guī)、智能的數(shù)字化實驗室新生態(tài)，推動實驗室運營邁向智能化與高效化的新階段。
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2023-06-16 14:28:25構(gòu)建表達載體想降本增效？看這一篇就夠了
想要開發(fā)有穩(wěn)定生產(chǎn)能力的細胞株，除了在細胞開發(fā)中對于細胞表達能力的評估篩選以外，前期的表達載體的構(gòu)建過程也非常重要。使用納升移液技術(shù)可以顯著提高細胞株過程基因合成，表達載體構(gòu)建以及轉(zhuǎn)染篩選等實驗的實驗效率，降低實驗成本。聲波移液展示Echo?移液系統(tǒng)依靠專 利技術(shù)（U.S. Patent 6938995）和創(chuàng)新方法改變移液操作在整個生命科學(xué)領(lǐng)域中的應(yīng)用。它采用動態(tài)液體分析（Dynamic Fluid Analysis?, DFA）技術(shù)和聲波移液（Acoustic Droplet Ejection，ADE）技術(shù)，讓研究人員能夠移取多種不同類型的液體，完成微量小體積（2.5/25nL）的移液工作。全流程無需槍頭耗材，無交叉風(fēng)險。納升移液技術(shù)讓細胞株構(gòu)建更快、更準(zhǔn)、更經(jīng)濟更快—— Echo快速任意孔到任意孔移液，極速基因組裝在質(zhì)粒構(gòu)建前期，需要非常多的準(zhǔn)備實驗，如基因組裝中將不同的DNA片段混合，在檢測反應(yīng)中將不同的樣本組合，在NGS文庫構(gòu)建過程中將多個文庫pooling到一起，在CRISPr基因編輯中構(gòu)建sgRNA文庫等等，這些實驗都需要進行快速、靈活的加樣移液，就算使用高通量的移液工作站，往往也要好幾小時才能完成。納升移液技術(shù)Echo的任意孔到任意孔的快速移液特點則讓此類應(yīng)用簡單、快速化，每次轉(zhuǎn)移花費更少時間更短。這為基因組裝節(jié)省了高達82%的時間。從母板任意孔轉(zhuǎn)移任意體積樣品到目標(biāo)板任意孔中，實現(xiàn)快速挑選、樣品混合和組合。有效縮短實驗周期更準(zhǔn)—— Echo加樣精 準(zhǔn)，提高克隆效率利用質(zhì)粒上含有的抗性選擇進行篩選，需要對篩選結(jié)果進行鑒定， 而qPCR也是常用的鑒定方法之一。使用Echo納升移液技術(shù)進行微量化克隆篩選鑒定，可以以更少的實際成本精 準(zhǔn)完成實驗。使用Echo完成 qPCR的反應(yīng)體系構(gòu)建，通過減少每個組件的體積，并使用不使用tips的Echo，將反應(yīng)體積縮小10倍，從10 μL減少到1 μL，成本降低了8倍。精 準(zhǔn)減小實驗體積更經(jīng)濟—— Echo微量化，縮小反應(yīng)體系，讓新技術(shù)更經(jīng)濟系統(tǒng)化的設(shè)計必然會帶來更大的樣本量，從而導(dǎo)致更高的費用， Echo采用聲波的能量進行無接觸式移液，且每滴液滴僅為2.5nL或25nL，因此可以直接省去吸頭耗材的消耗，也可以將檢測反應(yīng)體系降低4-100倍，使成本急劇下降。有效縮減試劑成本Gibson and Golden Gate Assembly實驗：不同反應(yīng)體積的成本效益和組裝效率比較產(chǎn)品信息“僅用于科研，不用于臨床診斷”
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2022-11-21 10:19:06“沃”的實驗 | 13份動物模型構(gòu)建方法系列資料上新，造模不再難！
在做基礎(chǔ)研究時加入動物實驗不僅會使研究工作更完善，也會提高投稿的命中率，但是想把實驗做成功卻不是件容易的事兒，因為在動物造模中總遇到各種難題：搞不清動物建模標(biāo)準(zhǔn)化的流程，做起實驗磕磕絆絆造模需要注意的細節(jié)多，反復(fù)摸索十幾遍才造模成功明明按照文獻中的實驗方法造模，卻還老是不成功“沃”的實驗全網(wǎng)最全的生命科學(xué)研究線上學(xué)習(xí)平臺第二期內(nèi)容：常見疾病動物模型——構(gòu)建方法系列2幫助大家解決造模中遇到的難題第二期內(nèi)容有什么？“沃”的實驗——全網(wǎng)最全的生命科學(xué)研究線上學(xué)習(xí)平臺第二期內(nèi)容，為大家分享常見疾病動物模型構(gòu)建方法，涵蓋8大視頻課程+2大實驗手冊+3大建模的標(biāo)準(zhǔn)操作流程。5位老師線上為你講解不同動物模型的背景、造模方法等內(nèi)容，理論結(jié)合實踐，希望能給大家的動物建模帶來更多新思路和新靈感。點擊鏈接，即可進入學(xué)習(xí)  8大視頻課程  2大實驗手冊  3大建模的標(biāo)準(zhǔn)操作流程歡迎大家收藏「“沃”的實驗」線上學(xué)習(xí)平臺學(xué)習(xí)平臺，內(nèi)容將持續(xù)更新下期內(nèi)容預(yù)告： 實驗動物手術(shù)操作-手術(shù)方法 
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2022-04-18 13:45:53Neuron：北大李毓龍課題組構(gòu)建一種全新的ATP熒光探針
文章概述三磷酸腺苷（Adenosine 50-triphosphate，ATP）是一種廣泛存在于體內(nèi)的能量存儲分子。除了參與細胞內(nèi)的能量代謝功能外，越來越多的證據(jù)表明，釋放到細胞外空間的ATP可以作為一種分子信號（嘌呤能遞質(zhì)），能夠結(jié)合并激活離子型P2X受體以及代謝型P2Y受體。在神經(jīng)系統(tǒng)中，釋放的ATP參與了多中生理病理過程，包括痛覺感受、機械/化學(xué)感知信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、突觸傳遞、損傷、炎癥等。對于ATP在這些生理過程中的作用，目前的研究并未完全闡明。為了進一步研究ATP的生理功能，2021年12月22日，北京大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院李毓龍教授團隊發(fā)表在《Neuron》期刊上發(fā)表題為“A sensitive GRAB sensor for detecting extracellular ATP in vitro and in vivo”的研究論文，該項工作展示了團隊最新開發(fā)的一種可遺傳編碼的熒光分子探針——GRABATP1.0（簡稱ATP1.0；GRAB：G protein-coupled receptor activation-based sensors），該探針以P2Y受體作為ATP的結(jié)合支架，能夠?qū)毎獾腁TP進行高靈敏度、高選擇性以及高時空分辨率的實時測量。該項工作是李毓龍教授團隊在相繼開發(fā)了乙酰膽堿、多巴胺、去甲腎上腺素、血清素和腺苷等一系列分子探針之后的后又一重要成果，對于我們深入研究并理解ATP的生理功能具有重要意義。核心觀點1、ATP1.0是一個可遺傳編碼的細胞外ATP感受器；2、ATP1.0對于細胞外ATP具有高敏感性和高時空分辨率；3、ATP1.0可用于離體以及在體ATP釋放的實時監(jiān)測。研究結(jié)果分析1. ATP1.0表現(xiàn)出卓越的細胞外ATP檢測性能為了開發(fā)一個遺傳編碼的ATP熒光探針，研究者首先系統(tǒng)地篩選了能夠被ATP激活的G蛋白耦合受體（G protein-coupled receptors, GPCRs），包括人源的P2Y1、P2Y2、P2Y4、P2Y11、P2Y12和P2Y13等。以這些GPCRs作為支架，研究者將結(jié)構(gòu)敏感的綠色熒光蛋白（circularly permuted enhanced GFP, cpEGFP）插入到這些受體結(jié)構(gòu)中。其中hP2Y1在插入cpEGFP后表現(xiàn)出最佳的膜轉(zhuǎn)運和對ATP的響應(yīng)性，因此隨后研究者選擇了基于hP2Y1的嵌合體ATP0.1進行進一步優(yōu)化，并且最終得到了對ATP熒光響應(yīng)性最 好的ATP1.0。當(dāng)ATP1.0在HEK293T細胞中表達時，它能夠很好的被運輸?shù)郊毎ど媳磉_，并對細胞外100mM的ATP產(chǎn)生一個~500%的dF/F0峰值。在特異性方面，ATP1.0對細胞外ATP的反應(yīng)能夠被P2Y1的拮抗劑MRS-2500阻斷。ATP1.0對其它遞質(zhì)不會產(chǎn)生反應(yīng)，包括谷氨酸、GABA、甘氨酸、多巴胺、去甲腎上腺素、血清素、組胺和乙酰膽堿等，對二磷酸腺苷（Adenosine Diphosphate, ADP）的反應(yīng)與ATP類似，但是對于其它結(jié)構(gòu)類似的嘌呤能分子或衍生物，如一磷酸腺苷、腺苷、二磷酸尿核苷等幾乎不產(chǎn)生反應(yīng)。ATP1.0的反應(yīng)具有快速動力學(xué)的特征，其反應(yīng)平均上升時間常數(shù)約為28 ms，平均衰減時間常數(shù)約為283 ms。在熒光強度上，ATP1.0被ATP激活時的亮度達到了直接表達hP2Y1-EGFP融合蛋白熒光強度的64%，并且ATP1.0在單光子激發(fā)下的光譜與EGFP相似，激發(fā)峰在500 nm，發(fā)射峰在520 nm。在與其它細胞外ATP分子探針的比較中，ATP1.0表現(xiàn)出更大的動態(tài)檢測范圍、更強的熒光反應(yīng)、以及更低的信噪比。接下來，研究者探討了ATP1.0在原代培養(yǎng)的星形膠質(zhì)細胞和神經(jīng)元中的表達能力以及反應(yīng)性。ATP1.0能夠廣泛的表達到星形膠質(zhì)細胞和神經(jīng)元的細胞上，包括胞體、突起等部位。表達到星形膠質(zhì)細胞和神經(jīng)元上的ATP1.0對細胞外ATP均有較好的反應(yīng)，其平均dF/F0峰值分別約為1000%和780%。此外，ATP誘導(dǎo)的熒光反應(yīng)也能夠被P2Y1、受體拮抗劑MRS-2500阻斷。此外，與HEK293T中結(jié)果相似，神經(jīng)元中表達的ATP1.0對ATP和ADP均有反應(yīng)，但對一磷酸腺苷、腺苷、二磷酸尿核苷均無反應(yīng)。更重要的是，ATP1.0在細胞表面非常穩(wěn)定，在給予10mM 的ATP 兩小時后，表達ATP1.0的神經(jīng)元的熒光沒有出現(xiàn)明顯下降。綜上所述，ATP1.0能夠適用于多種類型的細胞，對細胞外的ATP產(chǎn)生高靈敏度、高選擇性和高穩(wěn)定性的熒光增強反應(yīng)。2. ATP1.0可用于監(jiān)測體外培養(yǎng)細胞外的ATP水平接下來，研究者測試了ATP1.0是否能夠用于檢測神經(jīng)-膠質(zhì)共培養(yǎng)細胞中內(nèi)源性ATP的釋放。在大腦中，機械刺激和細胞腫脹均能誘發(fā)胞內(nèi)ATP被釋放。在表達ATP1.0的細胞中，給予細胞機械刺激（利用玻璃微電極按壓某個細胞），能夠引起一個快速、局部增強的dF/F0信號，反映了ATP的釋放。為了誘導(dǎo)細胞腫脹，研究者將細胞浸泡在低滲溶液（130 mOsm/kg）中;在1min內(nèi)，dF/F0信號顯著增加。并且在應(yīng)用MRS-2500后，這兩種刺激引起的反應(yīng)都被完全抑制。研究者還發(fā)現(xiàn)，低滲刺激誘導(dǎo)的ATP釋放可能不需要依賴經(jīng)典的SNARE囊泡釋放機制，因為細胞表達了破傷風(fēng)毒素輕鏈（tetanus toxin light chain, TeNT，可以切割突觸短肽并阻止胞外分泌過程），但是對低滲刺激誘導(dǎo)的反應(yīng)沒有影響；而作為對照，表達TeNT阻斷了低滲刺激誘發(fā)的谷氨酸釋放。除了刺激誘發(fā)的ATP釋放外，研究者還觀察到，即使在沒有外部刺激的情況下，神經(jīng)-膠質(zhì)共培養(yǎng)細胞中也存在自發(fā)、局部、以及短暫的ATP1.0信號。在1.6mm2成像視野中，這些自發(fā)事件以1.2次/min的速率出現(xiàn)，其dF/F0的平均峰值約為210%。ATP自發(fā)釋放的平均上升時間約為11s，衰減時間約為43s，其釋放范圍的平均直徑約為32mm。為了確保ATP1.0信號反映了細胞外的ATP動態(tài)變化，研究者利用三磷酸腺苷雙磷酸酶（ATP的水解酶）對細胞進行處理并成像，觀察到三磷酸腺苷雙磷酸酶能夠顯著阻斷自發(fā)事件的發(fā)生。與以前的檢測手段相比，ATP1.0具備更高的靈敏度，能夠在普通條件下特異性的檢測ATP的釋放。3. ATP1.0可用于監(jiān)測斑馬魚幼體中ATP的動態(tài)變化在證明了ATP1.0可用于體外ATP的檢測后，研究者接著探討了它是否可以用于監(jiān)測體內(nèi)（如斑馬魚中）ATP的動態(tài)變化。在斑馬魚幼體神經(jīng)元中特異性地表達ATP1.0后，利用ATP局部處理會引起視頂蓋中dF/ F0信號出現(xiàn)強烈的瞬時增加，這些信號能夠被MRS-2500阻斷。在驗證了ATP1.0能夠?qū)ν庠碅TP做出反應(yīng)后，研究者進一步探討了ATP1.0是否能夠用于檢測活斑馬魚內(nèi)源性ATP的釋放。ATP信號在促進小膠質(zhì)細胞向損傷部位遷移中發(fā)揮關(guān)鍵作用。在表達ATP1.0的斑馬魚中，研究者發(fā)現(xiàn)激光消融誘導(dǎo)視頂蓋損傷后會導(dǎo)致熒光增強，其反應(yīng)從損傷部位向外呈放射狀傳播。損傷后11s和64s釋放ATP的范圍，其平均直徑分別為~23mm和~34mm。接下來，研究者通過在斑馬魚的視頂葉中表達ATP1.0，同時監(jiān)測ATP的釋放和小膠質(zhì)細胞的遷移，斑馬魚的小膠質(zhì)細胞用紅色熒光蛋白DsRed標(biāo)記。研究者們發(fā)現(xiàn)，在激光消融后，小膠質(zhì)細胞沿著ATP傳播路徑逐漸遷移到損傷部位。因此，ATP1.0非常適用于活體斑馬魚幼蟲ATP監(jiān)測，并且具有較高的時空分辨率。4. ATP1.0可用于監(jiān)測小鼠全身炎癥引起的ATP局部釋放ATP是應(yīng)對機體急慢性炎癥反應(yīng)的關(guān)鍵細胞外信使，但是在全身炎癥期間ATP釋放的模式還不清楚。研究者在小鼠腹腔注射細菌脂多糖（lipopolysaccharides, LPS）誘導(dǎo)全身炎癥，并通過雙光子顯微鏡來觀察直接觀察視覺皮層ATP1.0的熒光反應(yīng)。注射LPS 24小時后，研究者觀察到皮質(zhì)內(nèi)多次ATP局部釋放事件，在記錄的20min內(nèi)，其發(fā)生頻率約為5 – 10次/min。在星形膠質(zhì)細胞中，ATP釋放的上升時間相對較快（
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2022-05-19 15:21:24線栓法構(gòu)建的局灶性腦缺血模型，你會么？
為什么要構(gòu)建局灶性腦缺血模型？世衛(wèi)組織《2020全 球衛(wèi)生估計》統(tǒng)計顯示，2019年10大死亡原因中有7個是非傳染性疾病。其中，中風(fēng)是第二大死亡原因，占總死亡人數(shù)的11%。中風(fēng)，又稱“腦卒中”、“腦血管意外”，是一種急性腦血管疾病，包括缺血性和出血性卒中，其中缺血性腦血管病占60-70%。缺血性腦血管病嚴(yán)重危害人類的健康，建立一種與人腦梗塞類似的動物模型使之適合溶栓治療研究具有重要的研究意義和實用價值。卒中又名大腦中動脈栓塞（middle cerebral artery occlusion，MCAO），是一種局灶性腦缺血模型，也是目前應(yīng)用最廣泛的腦缺血模型。其發(fā)病機理與人類缺血性腦卒中表現(xiàn)相似，對于制作模擬人腦缺血模型對腦缺血發(fā)病機制及藥物篩選有重要意義。如何構(gòu)建局灶性腦缺血模型？構(gòu)建局灶性腦缺血模型方式有很多種，栓塞法、線栓法及光化學(xué)方法等。小沃今天就教你如何運用 線栓法 建立一個完美的局灶性腦缺血模型。認(rèn)識線栓法Koizumi于日本卒中會議(1985)首次報道了可逆性MCAO模型，解決了大鼠局灶腦缺血再灌流損傷研究的難題。分離暴露頸部血管，從ECA或CCA分叉處插入4～0尼龍線，進入ICA，阻斷MCA起始端及其所有側(cè)支血液供應(yīng)，導(dǎo)致MCA區(qū)局灶缺血。一定時間后輕輕提拉插線，有阻力時提示絲線頭端已達ECA或CCA切口處，制做成再灌流模型，不需再次切開頸部。線栓法分類目前該模型具有代表性的方法有兩類，即Longa法川和Koizumi法。前者是把尼龍線頭端燒成球形，后者在尼龍線遠端徐一層硅酮彈性體（長度5 mm，直徑0.25 mm），便于插入ICA并脹緊血管。Laing對上述兩種方法做了對比研究，發(fā)現(xiàn)兩者腦缺血中心區(qū)細胞壞死和腦血流改變相差顯著，Koizumi法閉塞效果更好。線栓法優(yōu)點線栓法的優(yōu)點在于模型制作不用開顱，MCAO效果也比較理想，是目前普遍使用的能觀察再灌流損傷的局灶性腦缺血模型。線栓法實操詳細解說用線栓法建立局灶性腦缺血模型的每一個流程，長按圖片還可直接保存流程圖。圖文演示，讓你的動物實驗不再困難。
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抗體文庫構(gòu)建
Fluke 435-II
三氣分析儀
構(gòu)建噬菌體文庫