線栓法構(gòu)建的局灶性腦缺血模型，你會么？
深圳市瑞沃德生命科技有限公司-
為什么要構(gòu)建局灶性腦缺血模型？
世衛(wèi)組織《2020全 球衛(wèi)生估計》統(tǒng)計顯示，2019年10大死亡原因中有7個是非傳染性疾病。其中，中風(fēng)是第二大死亡原因，占總死亡人數(shù)的11%。中風(fēng)，又稱“腦卒中”、“腦血管意外”，是一種急性腦血管疾病，包括缺血性和出血性卒中，其中缺血性腦血管病占60-70%。
缺血性腦血管病嚴(yán)重危害人類的健康，建立一種與人腦梗塞類似的動物模型使之適合溶栓治療研究具有重要的研究意義和實用價值。卒中又名大腦中動脈栓塞（middle cerebral artery occlusion，MCAO），是一種局灶性腦缺血模型，也是目前應(yīng)用最廣泛的腦缺血模型。其發(fā)病機理與人類缺血性腦卒中表現(xiàn)相似，對于制作模擬人腦缺血模型對腦缺血發(fā)病機制及藥物篩選有重要意義。
如何構(gòu)建局灶性腦缺血模型？
構(gòu)建局灶性腦缺血模型方式有很多種，栓塞法、線栓法及光化學(xué)方法等。小沃今天就教你如何運用 線栓法 建立一個完美的局灶性腦缺血模型。
認(rèn)識線栓法
Koizumi于日本卒中會議(1985)首次報道了可逆性MCAO模型，解決了大鼠局灶腦缺血再灌流損傷研究的難題。分離暴露頸部血管，從ECA或CCA分叉處插入4～0尼龍線，進入ICA，阻斷MCA起始端及其所有側(cè)支血液供應(yīng)，導(dǎo)致MCA區(qū)局灶缺血。一定時間后輕輕提拉插線，有阻力時提示絲線頭端已達ECA或CCA切口處，制做成再灌流模型，不需再次切開頸部。
線栓法分類
目前該模型具有代表性的方法有兩類，即Longa法川和Koizumi法。前者是把尼龍線頭端燒成球形，后者在尼龍線遠端徐一層硅酮彈性體（長度5 mm，直徑0.25 mm），便于插入ICA并脹緊血管。Laing對上述兩種方法做了對比研究，發(fā)現(xiàn)兩者腦缺血中心區(qū)細(xì)胞壞死和腦血流改變相差顯著，Koizumi法閉塞效果更好。
線栓法優(yōu)點
線栓法的優(yōu)點在于模型制作不用開顱，MCAO效果也比較理想，是目前普遍使用的能觀察再灌流損傷的局灶性腦缺血模型。
線栓法實操
詳細(xì)解說用線栓法建立局灶性腦缺血模型的每一個流程，長按圖片還可直接保存流程圖。圖文演示，讓你的動物實驗不再困難。
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- 線栓法構(gòu)建的局灶性腦缺血模型，你會么？
為什么要構(gòu)建局灶性腦缺血模型？
世衛(wèi)組織《2020全 球衛(wèi)生估計》統(tǒng)計顯示，2019年10大死亡原因中有7個是非傳染性疾病。其中，中風(fēng)是第二大死亡原因，占總死亡人數(shù)的11%。中風(fēng)，又稱“腦卒中”、“腦血管意外”，是一種急性腦血管疾病，包括缺血性和出血性卒中，其中缺血性腦血管病占60-70%。
缺血性腦血管病嚴(yán)重危害人類的健康，建立一種與人腦梗塞類似的動物模型使之適合溶栓治療研究具有重要的研究意義和實用價值。卒中又名大腦中動脈栓塞（middle cerebral artery occlusion，MCAO），是一種局灶性腦缺血模型，也是目前應(yīng)用最廣泛的腦缺血模型。其發(fā)病機理與人類缺血性腦卒中表現(xiàn)相似，對于制作模擬人腦缺血模型對腦缺血發(fā)病機制及藥物篩選有重要意義。
如何構(gòu)建局灶性腦缺血模型？
構(gòu)建局灶性腦缺血模型方式有很多種，栓塞法、線栓法及光化學(xué)方法等。小沃今天就教你如何運用 線栓法 建立一個完美的局灶性腦缺血模型。
認(rèn)識線栓法
Koizumi于日本卒中會議(1985)首次報道了可逆性MCAO模型，解決了大鼠局灶腦缺血再灌流損傷研究的難題。分離暴露頸部血管，從ECA或CCA分叉處插入4～0尼龍線，進入ICA，阻斷MCA起始端及其所有側(cè)支血液供應(yīng)，導(dǎo)致MCA區(qū)局灶缺血。一定時間后輕輕提拉插線，有阻力時提示絲線頭端已達ECA或CCA切口處，制做成再灌流模型，不需再次切開頸部。
線栓法分類
目前該模型具有代表性的方法有兩類，即Longa法川和Koizumi法。前者是把尼龍線頭端燒成球形，后者在尼龍線遠端徐一層硅酮彈性體（長度5 mm，直徑0.25 mm），便于插入ICA并脹緊血管。Laing對上述兩種方法做了對比研究，發(fā)現(xiàn)兩者腦缺血中心區(qū)細(xì)胞壞死和腦血流改變相差顯著，Koizumi法閉塞效果更好。
線栓法優(yōu)點
線栓法的優(yōu)點在于模型制作不用開顱，MCAO效果也比較理想，是目前普遍使用的能觀察再灌流損傷的局灶性腦缺血模型。
線栓法實操
詳細(xì)解說用線栓法建立局灶性腦缺血模型的每一個流程，長按圖片還可直接保存流程圖。圖文演示，讓你的動物實驗不再困難。
- “沃”的實驗 | 免費直播！腦缺血模型構(gòu)建及檢測，助你快速掌握要領(lǐng)！
實驗動物該怎么選擇？
不同腦缺血模型，弄不清對應(yīng)構(gòu)建方法？
常用的血流監(jiān)測技術(shù)，你都掌握了嗎？
「全線賦能·“沃”的實驗」之實驗方法實戰(zhàn)教程
直播第五期為大家聚焦
《腦缺血模型構(gòu)建及檢測》
從實驗動物的選擇、不同模型的分類
各個模型的構(gòu)建方法到血流監(jiān)測技術(shù)
兩位老師將進行綜合詳細(xì)的講解
全面助力你的科研實驗研究
直播時間
6月21日（周二）19：00
報名方式
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主題：腦缺血模型構(gòu)建
腦缺血研究背景
腦缺血動物模型構(gòu)建
腦缺血模型構(gòu)建實驗儀器
講師：孫紹強
瑞沃德行業(yè)解決方案專家，在膜片鉗/鈣成像/干細(xì)胞誘導(dǎo)方面有著豐富的實驗經(jīng)驗，曾參與多項重大研發(fā)及自然科學(xué)基金項目，曾在Cell Stem Cell 上發(fā)表論文，專注于神經(jīng)疾病，腦缺血及神經(jīng)退行性疾病模型制備和機制研究，已為上百家客戶提供專業(yè)的神經(jīng)疾病整體解決方案。
主題：腦卒中研究中的血流監(jiān)測技術(shù)
激光多普勒
激光散斑
超聲多普勒
核磁共振成像
雙光子顯微鏡
講師：殷維君
瑞沃德微循環(huán)監(jiān)測解決方案專家，在生理信號監(jiān)測和血流血氧成像領(lǐng)域擁有豐富的經(jīng)驗，主導(dǎo)動物活體成像解決方案的設(shè)計及優(yōu)化，專注于臨床及臨床前微循環(huán)監(jiān)測解決方案的構(gòu)建。
上期直播間互動問題
這次我們?nèi)繛樾』锇榻獯?/b>
Q1：組織剪切的大小有沒有具體要求，腫瘤組織一般2-4mm可以嗎？
A1：這要根據(jù)組織類型去判斷，一般會預(yù)處理成10mm左右的組織塊，太大可能會導(dǎo)致處理不完全，太小可能導(dǎo)致細(xì)胞死亡增加，甚至導(dǎo)致樣本變稠等。
Q2：細(xì)胞活率80%就可以了嗎，看到一些資料寫的都要90%以上。
A2：這個需要根據(jù)下游實驗的需求靈活調(diào)整，如果樣本存活率不能達到要求的話，除了優(yōu)化實驗條件以外，還可以通過一些死細(xì)胞去除的試劑來優(yōu)化已獲得的樣本。
Q3：低溫解離細(xì)胞與常規(guī)的37度制備單細(xì)胞優(yōu)勢分別是什么？區(qū)別是什么？
A3：37℃條件下進行組織解離，由于細(xì)胞轉(zhuǎn)錄活躍，因此解離過程中基因表達可能會發(fā)生改變，可能會干擾應(yīng)激反應(yīng)相關(guān)基因表達，所以在進行snRNA-seq時可以通過使用冷活性酶釋放細(xì)胞核，同時一些熱敏感或者脆弱的細(xì)胞更適合采用低溫解離的分離方式，但是低溫條件對一些質(zhì)密難解離的組織的處理效率可能會降低。
另外，溫度對不同細(xì)胞種類也有一定影響，比如在進行腦組織解離時，熱解離可能會影響神經(jīng)元和星形膠質(zhì)細(xì)胞的獲取，但是會大量富集小膠質(zhì)細(xì)胞，所以在進行組織解離時，根據(jù)獲得目的細(xì)胞的需求要靈活調(diào)整解離方案。
Q4：裂紅處理有什么注意事項嗎？
A4：如果直徑6-8μm的細(xì)胞占比較高，且有核率偏低，這表明紅細(xì)胞含量可能較多，需要進行紅細(xì)胞裂解，如果紅細(xì)胞裂解依然不干凈，不建議增大裂解體系，建議適當(dāng)延長裂紅時間，或適當(dāng)增加裂紅次數(shù)。
Q5：流式染色時間及溫度如何選擇？
A5：染色本身取決于抗體抗原之間的結(jié)合能力，染色時間和溫度，受限于抗體濃度，一般根據(jù)選擇抗體的說明書推薦的濃度和孵育時間、溫度選擇。我的實踐經(jīng)驗：當(dāng)不清楚說明書的情況，我會選擇室溫染色12-15min（取決于抗體濃度微調(diào)），或4度冰上30min。注意染色時間盡量不要讓細(xì)胞破損，否則死細(xì)胞碎片會影響流式結(jié)果。此外細(xì)胞消化完畢后應(yīng)該盡快染色處理，特別是一些凋亡染色、胞內(nèi)酶染色為保持細(xì)胞物質(zhì)活性，應(yīng)盡快染色。
Q6：請問流式細(xì)胞實驗中單抗進行熒光需要什么樣的對照？
A6：關(guān)于對照設(shè)置，這個比較復(fù)雜，一般我們是選擇同型對照作為陰性對照組，得到的結(jié)果往往是比較好的。所謂的同型對照就是同種屬同亞型、相同熒光標(biāo)記物、使用劑量和濃度相同，且屬于非特異性結(jié)合的抗體為同型對照組。通常用來消除抗體與抗原的非特異性結(jié)合造成的背景染色。
還有一類就是最常見的純陰性對照，檢測細(xì)胞群不進行任何抗體處理，直接進行流式檢測，這就是簡單消除細(xì)胞和溶劑本身的影響，這種方法的好處是節(jié)約抗體，畢竟抗體很貴。
Q7：如何減少補償?shù)母蓴_？
A7：補償干擾往往是多激光的流式儀器才會發(fā)生一定干擾情況，此時，可以根據(jù)抗體公司提供的染料搭配方案選擇比較好，也就是發(fā)射光譜的波長峰盡量不重疊的染料，這樣補償干擾會盡量消除。因此，往往需要查看染料的波長范圍，此外，對于4色以上的多色標(biāo)記情況，一般不常見，此時往往染料的波長范圍難以避免的重疊，這時候，推薦使用抗體公司推薦的配色方案，盡量避免發(fā)射光譜的重疊。此外很多流式儀器配套軟件都帶一定算法對補償進行修正，可以適當(dāng)修正這個影響。
Q8：細(xì)胞自發(fā)熒光如何解決？
A8：細(xì)胞自發(fā)熒光往往是細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)帶有熒光，植物細(xì)胞因為葉綠素原因會自帶一定熒光，然后一些藥物處理下，藥物本身帶有發(fā)色基團，也可能自熒光，此時，純陰性對照的設(shè)置可以補償一定的情況。然后就是染料的選擇情況，染料熒光波長范圍避免與細(xì)胞自發(fā)熒光的波長的重疊，這樣會比較好一些。我之前做藥物的細(xì)胞凋亡實驗時候，考慮到藥物的情況，就沒有使用常見的凋亡檢測的Annexin V染料，而改用Annexin V-APC 。盡量設(shè)置純陰性對照、有條件做下同型對照，往往可以在數(shù)據(jù)處理時候適當(dāng)減少部分因素的影響。這樣流式的結(jié)果會更好。
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- 良性囊性病變，局灶被覆鱗狀上皮，伴組織細(xì)胞和多核巨細(xì)胞反應(yīng)
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- IVIS視角 | 活體成像助力隱孢子蟲感染可視化模型構(gòu)建
隨著生活水平和YL衛(wèi)生狀況的不斷提升，寄生蟲感染在我們?nèi)粘Ｉ钪兴坪跻讶諠u陌生。但在一些欠發(fā)達地區(qū)，由于貧困和不良的衛(wèi)生習(xí)慣造成的寄生蟲感染仍然威脅著無數(shù)生命。隱孢子蟲作為一種常見的人畜共患寄生蟲感染性疾病，是導(dǎo)致腹瀉病的主要原因。由于其經(jīng)由糞便傳播，所以常經(jīng)由水體污染而在衛(wèi)生條件較差的地區(qū)發(fā)生群體性感染。感染通常是自限性的，健康的成年人在發(fā)生第 一階段的較嚴(yán)重的腹瀉之后便可恢復(fù)，但糞便仍可能具有傳染性。新生兒或免疫力低下的如艾滋病患者或經(jīng)免疫YZZL的病人在感染后病情較嚴(yán)重，是兒童早期死亡、營養(yǎng)不良和生長遲緩的重要原因，也是艾滋病人并發(fā)腹瀉死亡的主要原因。
現(xiàn)今發(fā)現(xiàn)的隱孢子蟲共有15個亞種，分別感染人、家禽、寵物、牲畜以及一些野生動物。由于不了解其致病機制，目前的ZL方案往往是對癥用藥而非對因用藥。由于不同物種間感染模式差異，在實驗動物(主要為牛等家畜)上應(yīng)對隱孢子蟲感染的有效疫苗往往對預(yù)防人的感染收效甚微。
針對以上問題，來自美國賓大獸醫(yī)學(xué)院的研究人員發(fā)現(xiàn)了一種可用在小鼠模型中模擬與人患隱孢子蟲病相似病癥的隱孢子蟲(Cryptosporidium tyzzeri), 同時利用IVIS小動物活體成像系統(tǒng)幫助他們在體研究隱孢子蟲的感染以及宿主經(jīng)寄生蟲或疫苗免疫激活后的抗感染現(xiàn)象。該研究于近期發(fā)表在Cell子刊Cell Host & Microbe上。
要在小鼠體內(nèi)模擬人患隱孢子蟲病的合理模型，首先就需要找到相應(yīng)的隱孢子蟲。作者在農(nóng)場收集了大量小家鼠糞便，經(jīng)由測序，鑒定出一株與感染人的兩種隱孢子蟲(C. parvum和C. hominis)Z接近的一種鼠隱孢子蟲(C. tyzzeri)。同時為了后續(xù)在體觀察其感染模式以及宿主抗感染效果，作者通過CRISPR-Cas9技術(shù)將Luciferase基因和mCherry熒光蛋白導(dǎo)入到隱孢子蟲的基因組中，構(gòu)建了一株可以進行活體以及顯微觀察的隱孢子蟲。
圖一C. tyzzeri的鑒定以及基因編輯 (上：隱孢子蟲種間基因組相似性比較，AB為常見感染人的兩種隱孢子蟲，C為常見感染鼠的隱孢子蟲)
構(gòu)建好的隱孢子蟲就可以進行活體觀察了，由于有活力的隱孢子蟲可以表達Luciferase，在底物熒光素的作用下便可自發(fā)熒光，通過IVIS活體成像系統(tǒng)來實時監(jiān)測體內(nèi)隱孢子蟲的繁殖情況。作者將這一光學(xué)觀察方式與傳統(tǒng)的糞便qPCR檢測結(jié)果進行驗證，二者具有很好的一致性。作者除了觀察到這一新鑒定的隱孢子蟲感染和人患隱孢子蟲病的感染部位以及病理表征一致之外，還觀察到了具有免疫缺陷的鼠(IFN-γ、Rag基因的敲除鼠 )也更易受到隱孢子蟲的危害，這一點與臨床上免疫缺陷病人的高發(fā)病致死率也剛好吻合。
圖二 C. tyzzeri感染模式觀察
有了這一能夠很好模擬人隱孢子蟲感染的實驗動物模型之后，便可以利用這一模型進行隱孢子蟲的ZL以及疫苗的開發(fā)。由于臨床上隱孢子蟲高發(fā)地區(qū)人們在感染痊愈后再度感染的概率大大降低，因此作者首先檢驗了蟲體是否可以直接作為疫苗來進行感染的預(yù)防。利用未經(jīng)Luciferase標(biāo)記的C. tyzzeri進行第 一次感染，同時實驗組使用滅活的蟲體作為疫苗進行第 一次免疫，在感染后用廣譜抗蟲藥巴龍霉素殺滅后用Luc標(biāo)記C. tyzzeri進行二次感染，能夠觀察到接觸活蟲的小鼠幾乎不會發(fā)生二次感染，而使用滅活蟲體作為疫苗無法激活體內(nèi)免疫系統(tǒng)進行后續(xù)的抗感染作用。
圖三 使用滅活的C. tyzzeri無法預(yù)防感染
因此作者想到可以使用減毒的活蟲對宿主進行第 一次免疫。通過射線進行寄生蟲減毒處理，可以降低其感染力至無害水平。在減毒活蟲感染后30天，在使用Luc標(biāo)記的C. tyzzeri進行感染，能夠觀察到該方法與野生型活蟲二次感染模型有著相同的抗感染作用，說明減毒的疫苗是一種行之有效的預(yù)防隱孢子蟲感染的方式。但是由于要調(diào)動自身免疫系統(tǒng)，這一方法在免疫缺陷的小鼠身上仍不奏效。
圖四 使用減毒疫苗可以有效對隱孢子蟲進行預(yù)防
雖然這篇文章也并未真正解決隱孢子蟲的抗感染問題，但是構(gòu)建出針對這一寄生蟲病的實驗小鼠模型已經(jīng)為后續(xù)的科研工作者嘗試更多ZL方案和預(yù)防措施提供了可操作可監(jiān)控的實驗工具。
參考文獻
1. A Genetically Tractable, Natural Mouse Model of Cryptosporidiosis Offers Insights into Host Protective Immunity. Adam Sateriale et al., 2019, Cell Host & Microbe 26, 1–12
https://doi.org/10.1016/j.chom.2019.05.00
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- 標(biāo)題：限時免費 | UC Davis 教授在線分享微循環(huán)研究成果和腦缺血模型制作經(jīng)驗
福利，福利！限時免費 | UC Davis實驗動物ZX主任及藥理系教授在線分享微循環(huán)研究成果和腦缺血模型制作經(jīng)驗。
非常榮幸能邀請到Y(jié)i-Je (Jay) Chen和Madeline Nieves-Cintrón在線上與瑞沃德的VIP客戶進行微循環(huán)研究學(xué)術(shù)交流。
本次課程，我們預(yù)留少量免費名額，作為福利贈送給儀器網(wǎng)的用戶，如果你正想了解【嚙齒類動物性別、年齡與腦缺血相關(guān)關(guān)系】；【缺血性卒中炎癥損傷】；【正常與缺血狀態(tài)的血管功能調(diào)節(jié)機制】……那么千萬不要錯過這次交流會！機會難得，先到先得，趕快來鎖定席位吧！。
直播內(nèi)容
BBB與中風(fēng)相關(guān)研究成果分享--微循環(huán)研究學(xué)術(shù)交流會 （中英文雙語交流會）
直播時間
2020/8/21上午10:00-11:30
直播形式
ZOOM在線學(xué)術(shù)報告+交流分享
主講嘉賓： Yi-Je (Jay) Chen PhD
Assistant Professor
Director of the Animal Models Core in the Cardiovascular Research Institute,
UC Davis Medical School
加利福尼亞大學(xué)戴維斯分校 UC Davis 動物實驗ZX主任報告主題
Blood-Brain Barrier (BBB) Endothelial Cells：Pathophysiology in Ischemic Stroke
研究方向Research Interests
He studies Ion channels in BBB endothelial cells and their contributions to edema formation and inflammation in the early stages of ischemic stroke.主要成果Research Output：
Article 22; Citations 437; h-Index 10; the highest Scopus citations up to 78.
2011年至今總計發(fā)表20+SCI論文，引用高達437次，h-Index高達10，有的Scopus citations達到78
主講嘉賓： Madeline Nieves-Cintron PhD
Assistant Professor In Residence, UC Davis Medical School加利福尼亞大學(xué)戴維斯分校 UC Davis 藥學(xué)系 副教授
報告主題：AKAP5 complex in hyperglycemia modulation of vascular function
研究方向Research Interests：She studies vascular smooth muscle ion channels, emphasizing ionic control of intracellular calcium and smooth muscle contractility, for their responses to health-relevant conditions such as diabetes, hypertension, and environmental pollutants.
主要成果Research Output：
Article 30; Citations 1404; h-Index 17; the highest Scopus citations up to 283.
總計發(fā)表文獻30; 引用高1404; h-Index 高達17; 有的Scopus citations達到 283.請掃碼二維碼快速獲取參會席位，祝您成功參會！
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