相信在PCR時大家遇到Z為關(guān)鍵的問題就是關(guān)于退火溫度的探索下面我們就來談?wù)勥@方面的內(nèi)容 1. 公式計算 退火溫度＝Tm－（5～8）；Tm＝4×（G＋C）＋2×（A＋T）首先用公式計算出引物Tm值，退火溫度粗略的比引物的Tm低5左右，此法所得結(jié)果較為粗略 2. 軟件計算 將設(shè)計的引物和PCR產(chǎn)物放到Oligo 6 或Primer5中去評價，軟件分析得出**的退火溫度和循環(huán)參數(shù)此法所得結(jié)果較為接近實際退火溫度 3. 用梯度PCR儀探索退火溫度 下面我們以12x8的96孔梯度PCR儀來為例說明首先設(shè)定溫度梯度，例如設(shè)定初始溫度為58，溫度梯度是12，那么每一排的溫度差就是12/12（可設(shè)12個溫度梯度的梯度PCR儀，每一排即每8個孔溫度相同）然后，PCR結(jié)束后點樣觀測哪個溫度的樣品條帶**，進而確定該引物的退火溫度 用梯度PCR儀尋找**PCR退火溫度方便簡單，能夠減少尋找**退火時所需PCR循環(huán)的次數(shù)和時間 4.關(guān)于引物產(chǎn)品說明書標明的退火溫度 一般情況下合理的退火溫度約是從55到70退火溫度的設(shè)定一般要比引物的Tm低5實驗過程中設(shè)置退火溫度時應(yīng)比引物產(chǎn)品說明書標明的退火溫度高出1~2** 以上就是常見關(guān)于退火溫度的探索，僅供參考實際操作中只要大家多多操作，認真探索，解決這個問題并不困難 梯度PCR基因擴增儀（科研及教學(xué)專用）