前言

空氣污染已成為全世界性公共衛(wèi)生挑戰(zhàn)，吸入性氣溶膠和細(xì)顆粒物能夠深入肺泡區(qū)域——這個占肺表面積99%的關(guān)鍵氣體交換場所。肺泡由I型上皮細(xì)胞負(fù)責(zé)氣體交換，II型上皮細(xì)胞產(chǎn)生表面活性物質(zhì)，兩類細(xì)胞在氣液界面共同維持肺泡功能。

長期以來，吸入毒理學(xué)研究主要依賴動物實(shí)驗(yàn)和簡單體外模型。最常用的A549細(xì)胞雖易于培養(yǎng)，但作為腫瘤來源細(xì)胞，其增殖失控、缺乏完整I型細(xì)胞特征、屏障功能弱等局限，難以真實(shí)反映肺泡生理狀態(tài)。

法國國家工業(yè)環(huán)境與風(fēng)險(xiǎn)研究所的Alunni等人利用A549和Ci-hAELVi兩種商業(yè)化細(xì)胞系，成功構(gòu)建了一個可在氣液界面穩(wěn)定存活72小時的共培養(yǎng)模型。該研究同時使用了VitroCell®和CULTEX® RFS兩種暴露系統(tǒng)，通過對比驗(yàn)證了模型的穩(wěn)健性。本文將對這一研究的核心發(fā)現(xiàn)進(jìn)行系統(tǒng)解讀。

研究背景與目的

1.1 為什么需要新的肺泡模型？

空氣污染通過吸入氣態(tài)污染物和細(xì)顆粒物影響呼吸系統(tǒng)，這些物質(zhì)可到達(dá)肺泡區(qū)域。肺泡占肺表面積的99%，主要由兩種細(xì)胞構(gòu)成：

• I型肺泡上皮細(xì)胞：覆蓋95%的肺泡表面，負(fù)責(zé)氣體交換
• II型肺泡上皮細(xì)胞：產(chǎn)生表面活性物質(zhì)，防止肺泡塌陷，是I型細(xì)胞的祖細(xì)胞

然而，傳統(tǒng)的體外研究大多依賴單一細(xì)胞系，最常用的是A549細(xì)胞。A549雖被廣泛使用，但它存在明顯局限：

• 源于肺腺癌，增殖失控，易形成多層細(xì)胞聚集體
• 缺乏完整的I型細(xì)胞特征
• 屏障功能弱，無法真實(shí)模擬肺泡上皮1.2 研究目的

本研究旨在開發(fā)一種新的肺泡共培養(yǎng)模型，使用兩種商業(yè)化細(xì)胞系——A549（II型肺泡上皮樣細(xì)胞）和Ci-hAELVi（I型肺泡上皮樣細(xì)胞），使其適用于氣液界面的長時間暴露，為吸入毒理學(xué)提供更接近生理?xiàng)l件的體外工具。

實(shí)驗(yàn)材料與方法

2.1 細(xì)胞模型構(gòu)建

細(xì)胞來源：

• A549：人肺腺癌上皮細(xì)胞，ATCC編號CCL-185?
• Ci-hAELVi：人肺泡上皮慢病毒永生化細(xì)胞，InSCREENEx GmbH

細(xì)胞比例：按照人體肺泡中I型和II型細(xì)胞的數(shù)量比例，采用40% Ci-hAELVi + 60% A549。

培養(yǎng)基篩選：比較了RPMI 1640和huAEC兩種培養(yǎng)基。結(jié)果顯示：

• RPMI培養(yǎng)基中，A549增殖過快，會壓制Ci-hAELVi
• huAEC培養(yǎng)基使兩種細(xì)胞增殖速度相當(dāng)，A549不再形成聚集體，形成光滑均勻的單層

氣液界面適應(yīng)期：比較了兩種適應(yīng)期——24小時和6天。6天適應(yīng)表現(xiàn)出更好的屏障功能和穩(wěn)定性。

2.2 氣液界面暴露系統(tǒng)

本研究同時使用了兩種氣液界面暴露系統(tǒng)：

研究團(tuán)隊(duì)明確說明了兩套系統(tǒng)的選擇原因：“VitroCell®系統(tǒng)……不允許超過24小時的長時間暴露。CULTEX® RFS，更最近開發(fā)并由我們實(shí)驗(yàn)室購置，允許長時間動態(tài)暴露于氣流?！?.3 暴露條件優(yōu)化

• 氣流速度：10 mL/min/insert
• CO?濃度：約5%（維持培養(yǎng)基生理pH，避免使用HEPES）
• 溫度：37℃（循環(huán)水浴控制）
• 相對濕度：約80%（通過預(yù)熱培養(yǎng)基自生，避免細(xì)胞干燥）
• 預(yù)熱時間：暴露前30分鐘將培養(yǎng)基加入腔室并加熱至37℃，使腔室內(nèi)濕度達(dá)到飽和后再放入細(xì)胞2.4 陽性對照

• ZnO氣溶膠：1 mg/m3和2 mg/m3，使用CULTEX? RFS系統(tǒng)進(jìn)行24小時氣液界面暴露
• LPS：5 μg/mL和20 μg/mL，浸沒暴露24小時
• Triton X-100：1%，2小時暴露，作為細(xì)胞毒性陽性對照2.5 檢測指標(biāo)

• 細(xì)胞毒性：LDH釋放
• 代謝活性：PrestoBlue? assay
• 屏障功能：TEER、熒光黃通透性
• 基因表達(dá)：RT-qPCR檢測40+個標(biāo)志物
• 蛋白質(zhì)水平：免疫熒光、ELISA定量SP-B和SP-D
• 炎癥因子：IL-1β、IL-6、IL-8、TNF-α

研究結(jié)果

3.1 共培養(yǎng)模型的穩(wěn)定性

細(xì)胞計(jì)數(shù)：

• 培養(yǎng)7天后，A549單培養(yǎng)細(xì)胞數(shù)增加1.8倍，Ci-hAELVi單培養(yǎng)增加0.8-1.25倍
• 共培養(yǎng)細(xì)胞數(shù)增加約1.0倍，且標(biāo)準(zhǔn)偏差低于單培養(yǎng)，表明變異性更低、穩(wěn)定性更好

細(xì)胞毒性：

• 氣液界面適應(yīng)6天后，單培養(yǎng)和共培養(yǎng)在24小時潔凈空氣暴露下的LDH釋放與培養(yǎng)箱對照無顯著差異
• 代謝活性也與培養(yǎng)箱對照相當(dāng)

長時間暴露穩(wěn)定性（CULTEX® RFS系統(tǒng)驗(yàn)證）：

• 8、24、72小時潔凈空氣暴露后，LDH釋放均與培養(yǎng)箱對照無顯著差異
• 代謝活性在各時間點(diǎn)均保持正常3.2 標(biāo)志物表達(dá)

基因表達(dá)：

• 共培養(yǎng)表達(dá)AT1樣標(biāo)志物：CAV1（來自兩種細(xì)胞）、KRT14（主要來自Ci-hAELVi）
• AQP5和PDPN的mRNA在本研究條件下未檢測到
• 細(xì)胞粘附蛋白基因CDH1和ICAM-1主要來自Ci-hAELVi
• 黏蛋白基因MUC2、MUC5AC、MUC5B在共培養(yǎng)中相比A549單培養(yǎng)明顯下調(diào)
• 四種表面活性蛋白的mRNA均有表達(dá)

蛋白質(zhì)水平：

• SP-B：共培養(yǎng)分泌量是A549單培養(yǎng)的4倍，是Ci-hAELVi單培養(yǎng)的4倍（p < 0.0001）
• SP-D：培養(yǎng)箱條件下，共培養(yǎng)分泌量是A549單培養(yǎng)的3倍（p < 0.0001）；空氣暴露下，共培養(yǎng)SP-D水平下降，與單培養(yǎng)無顯著差異

免疫熒光：

• 共培養(yǎng)表達(dá)AT1特異性HTI-56和AT2特異性HTII-280膜蛋白
• A549細(xì)胞HTII-280染色更強(qiáng)，Ci-hAELVi細(xì)胞HTI-56染色更強(qiáng)
• Ci-hAELVi細(xì)胞共表達(dá)AQP5和PDPN，A549細(xì)胞兩種蛋白均未檢測到可及水平3.3 屏障功能

• A549單培養(yǎng)：TEER低，熒光黃通透性>60%，屏障功能弱
• Ci-hAELVi單培養(yǎng)：TEER高，熒光黃通透性<30%，屏障功能強(qiáng)
• 共培養(yǎng)：TEER約300 Ω·cm2，熒光黃通透性>50%，介于兩者之間3.4 功能驗(yàn)證：ZnO暴露

使用CULTEX® RFS系統(tǒng)進(jìn)行24小時ZnO氣溶膠暴露：

20 μg/mL LPS浸沒暴露24小時：

• 代謝活性下降30%
• LDH釋放無顯著變化（亞致死應(yīng)激）
• SP-B無顯著變化（變異性高）
• SP-D顯著升高
• IL-1β、IL-6、IL-8、TNF-α均顯著升高3.6 氣流本身的效應(yīng)

即使暴露于潔凈空氣，也觀察到：

• CYP1A1基因顯著上調(diào)（AhR通路激活）
• CAV-1下調(diào)，KRT14上調(diào)（細(xì)胞骨架重塑）
• 促炎細(xì)胞因子有輕微升高趨勢，但無統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性

兩種暴露系統(tǒng)對比

4.1 系統(tǒng)配置對比

從文獻(xiàn)中可以清晰看出研究團(tuán)隊(duì)的選擇策略：

用VitroCell®完成的任務(wù)：

• 共培養(yǎng)模型的建立和基礎(chǔ)表征
• 單培養(yǎng)與共培養(yǎng)的生長對比
• 24小時潔凈空氣暴露后的細(xì)胞毒性和代謝活性評估
• 基因表達(dá)和表面活性蛋白分泌的定量分析

用CULTEX® RFS完成的任務(wù)：

• 72小時長時間暴露驗(yàn)證
• ZnO氣溶膠的毒性測試
• 暴露時間效應(yīng)研究（8、24、72小時對比）4.3 關(guān)鍵數(shù)據(jù)一致性

兩套系統(tǒng)在24小時暴露條件下獲得的數(shù)據(jù)高度一致：

1. 設(shè)備年齡不等于能力：運(yùn)行超過10年的VitroCell?系統(tǒng)仍然產(chǎn)出高質(zhì)量數(shù)據(jù)，說明成熟穩(wěn)定的設(shè)備只要維護(hù)得當(dāng)，完全可以勝任基礎(chǔ)研究任務(wù)。
2. 長時間暴露能力是關(guān)鍵差異：只有CULTEX? RFS能夠支持72小時暴露，這使其成為研究慢性效應(yīng)的“利器”。
3. 氣溶膠暴露能力是分水嶺：本研究中，只有CULTEX? RFS被用于ZnO氣溶膠暴露，體現(xiàn)了其在氣溶膠毒性研究中的價值。
4. 數(shù)據(jù)可重復(fù)性比單項(xiàng)指標(biāo)更重要：兩套系統(tǒng)都產(chǎn)出了可重復(fù)的數(shù)據(jù)，證明了共培養(yǎng)模型的穩(wěn)健性。

討論

5.1 共培養(yǎng)模型的價值

本研究開發(fā)的A549/Ci-hAELVi共培養(yǎng)模型具有以下優(yōu)勢：

1. 穩(wěn)定性：共培養(yǎng)限制了A549的失控增殖，降低了變異性
2. 功能互補(bǔ)：SP分泌量是單培養(yǎng)的3-4倍，體現(xiàn)細(xì)胞間相互作用
3. 長時間存活：可在氣液界面穩(wěn)定存活72小時
4. 反應(yīng)靈敏：對ZnO和LPS均表現(xiàn)出預(yù)期的毒性反應(yīng)5.2 與現(xiàn)有模型的比較

作者坦誠指出：

1. 仍為細(xì)胞系：與原代細(xì)胞存在差異
2. 缺乏免疫細(xì)胞：無法完全模擬炎癥反應(yīng)
3. 無機(jī)械拉伸：無法模擬呼吸運(yùn)動
4. 氣流本身的機(jī)械效應(yīng)：即使?jié)崈艨諝庖矔鸹虮磉_(dá)變化，需作為背景考慮

結(jié)論

本研究成功開發(fā)了一種A549和Ci-hAELVi細(xì)胞的共培養(yǎng)模型，該模型：

• 在氣液界面穩(wěn)定存活長達(dá)72小時
• 表達(dá)AT1和AT2的關(guān)鍵標(biāo)志物
• SP分泌量是單培養(yǎng)的3-4倍
• 對ZnO和LPS表現(xiàn)出預(yù)期的毒性反應(yīng)
• 在兩種不同的氣液界面暴露系統(tǒng)中均表現(xiàn)穩(wěn)定

作者總結(jié)道：“這個模型在生理相關(guān)性和實(shí)際可及性之間提供了有效的平衡，非常適合用于初步吸入毒理學(xué)篩選，特別是在需要快速部署、低成本和高可重復(fù)性的情況下?！?/p>

研究設(shè)備
7.1 本研究所用設(shè)備

本研究中使用的CULTEX® RFS系統(tǒng)成功驗(yàn)證了共培養(yǎng)模型在72小時長時間暴露中的穩(wěn)定性，并完成了ZnO氣溶膠的毒性測試。德伯科技是CULTEX中國技術(shù)服務(wù)中心，其自主研發(fā)的ACP系列氣液界面細(xì)胞暴露系統(tǒng)，是CULTEX細(xì)胞暴露系統(tǒng)的國產(chǎn)替代方案：可完全滿足此類研究的實(shí)驗(yàn)需求：

• ACP3/6/16系列：3、6、16通道靈活配置，各通道間氣溶膠均一性變異系數(shù)≤5%
• 環(huán)境控制：溫度37±0.1℃，濕度≥95%，完美復(fù)刻人體氣道微環(huán)境
• 長時間穩(wěn)定運(yùn)行：支持≥24小時連續(xù)暴露，滿足長時間實(shí)驗(yàn)需求
• 全自動軟件控制：支持氣密性檢測、培養(yǎng)基自動加注、實(shí)驗(yàn)程序編輯、自動清洗等功能
• 與各類氣溶膠發(fā)生系統(tǒng)兼容：可連接Collison霧化器、粉塵發(fā)生器、煙霧發(fā)生器等
• Mistber靜態(tài)暴露模塊：適用于需要長時間、低流速穩(wěn)定暴露的特定研究場景

德伯科技致力于為國內(nèi)科研工作者提供從設(shè)備到方法學(xué)的全方位支持，助力中國吸入毒理學(xué)研究邁向國際前沿。

   參考文獻(xiàn)

Alunni A, Simonin O, Barbier G, et al. A549 and Ci-hAELVi cell lines coculture as a new human alveolar epithelium model for air-liquid interface exposure. Toxicology in Vitro, 2026; 112:106200.

標(biāo)簽：細(xì)胞全煙氣暴露系統(tǒng)氣液面暴露系統(tǒng)ALI暴露系統(tǒng)