原文已發(fā)表在《發(fā)酵科技通訊》2012.10，第41卷4期P32-35

尾氣在線檢測分析在發(fā)酵中的應(yīng)用

劉仲匯，史建國，朱思榮，揚艷，高廣恒，李雪梅

山東省科學(xué)院生物研究所，山東省生物傳感器ZD實驗室，山東濟南，250014

摘要：通過尾氣在線檢測分析可獲取發(fā)酵過程重要的呼吸代謝參數(shù)CER,OUR,RQ等。這些參數(shù)反映了微生物的代謝狀況，無論對動力學(xué)研究還是優(yōu)化工藝、全面控制發(fā)酵過程、提高產(chǎn)量產(chǎn)率都具有重大意義。本文綜合論述了其在發(fā)酵各方面的應(yīng)用。

關(guān)鍵詞：發(fā)酵;尾氣; CO2;O2;CER;OUR;RQ

0 引言

發(fā)酵中尾氣組分濃度變化反映了整個發(fā)酵過程物質(zhì)的變化情況。特別是尾氣中CO2和O2的變化，包含了非常有價值的過程反應(yīng)信息。CO2是細(xì)胞呼吸和分解代謝的終產(chǎn)物,還是某些合成代謝的基質(zhì)。幾乎所有發(fā)酵均產(chǎn)生大量CO2。CO2的產(chǎn)生是一種重要的生長指標(biāo)，特別適用于早期生長階段。在對數(shù)生長期CO2的釋放在一定條件下與細(xì)胞量成正比。監(jiān)測CO2的生成是跟蹤生長活動的有效方法。氧是構(gòu)成細(xì)胞本身及代謝產(chǎn)物的組分之一。對于好氧發(fā)酵，無論是基質(zhì)的氧化、菌體的生長或是產(chǎn)物的代謝均需要大量的氧[1-2]。

通過發(fā)酵尾氣中的CO2及O2在線檢測分析，可以獲取發(fā)酵過程重要的呼吸代謝參數(shù)，如CO2釋放速率（CER）、攝氧率（OUR）、呼吸商（RQ）等。這些參數(shù)反映了微生物的代謝狀況，尤其能提供從生長向生產(chǎn)過渡或主要基質(zhì)間的代謝過渡指標(biāo)。CO2釋放率(Carbon-dioxide Escape Rate ，CER)是指單位時間、單位體積發(fā)酵液細(xì)胞釋放的CO2量。攝氧率（Oxygen Uptake Rate, OUR）是指單位時間、單位體積發(fā)酵液細(xì)胞消耗的氧。OUR取決于菌體濃度，也與發(fā)酵液的營養(yǎng)成分、溶解氧水平、菌體的生長速率以及碳源的種類和濃度等因素有關(guān)。CER除以OUR所得的商稱為呼吸商(Respiratory Quotient,RQ)。呼吸商是各種碳源在發(fā)酵過程中代謝狀況的指示值。在碳源限制且供氧充分的情況下，各種碳源都趨向于完全氧化，呼吸商應(yīng)接近于其理論值。而供氧不足時，碳源不完全氧化，可使呼吸商偏離理論值[3-5]。

目前發(fā)酵尾氣CO2和O2檢測分析技術(shù)已日臻成熟。其性能穩(wěn)定，可靠性高，可實現(xiàn)連續(xù)在線檢測。因是從尾氣取氣分析，對發(fā)酵無任何影響；也無需高溫滅菌，故為其應(yīng)用創(chuàng)造了有利條件。

近年來，尾氣分析在發(fā)酵中的應(yīng)用研究越來越廣泛深入。這些對于深入研究發(fā)酵過程機理，摸索、優(yōu)化發(fā)酵工藝，全面控制發(fā)酵過程具有重大意義；尤其在基因工程、生物制藥領(lǐng)域，能夠大大加快新品研發(fā)及產(chǎn)業(yè)化，穩(wěn)定生產(chǎn)，提高產(chǎn)率。

1 發(fā)酵過程狀態(tài)識別

微生物發(fā)酵是個復(fù)雜的生化過程。在宏觀上表現(xiàn)為整個發(fā)酵過程的有規(guī)律性,即一般都經(jīng)過遲滯期、對數(shù)生長期、穩(wěn)定期和衰亡期。然而由于諸多因素的影響,又使各個發(fā)酵階段與具體的時間關(guān)系表現(xiàn)為無規(guī)律性。這給發(fā)酵過程的準(zhǔn)確控制帶來困難。因此正確辨識發(fā)酵各個階段對于過程優(yōu)化控制具有重要意義。

研究表明,無論對于霉菌、酵母菌、細(xì)菌,單液相體系、雙液相體系,純種發(fā)酵、混合菌發(fā)酵,CER的變化與體系狀態(tài)的變化有著密切聯(lián)系,根據(jù)CER的變化規(guī)律可以有效、準(zhǔn)確地把握發(fā)酵過程。李強等對青霉素、古龍酸、二元酸和葡萄糖酸發(fā)酵四個體系CER的變化規(guī)律進行研究，分析了CO2釋放與發(fā)酵各個階段的關(guān)系，證明CER用于過程判斷及控制是可行的[6]。李元廣等在十三碳烷烴生產(chǎn)十三碳二元酸發(fā)醉中發(fā)現(xiàn)隨著菌體生長，CER不斷增大，當(dāng)菌體生長基本停止時，CER達(dá)到Zda值，然后便開始下降。據(jù)此可以通過CER來及時確定進入產(chǎn)酸期的**時間，即CER達(dá)到Zda值時[7]。

楊強大等利用在線檢測OUR對特定發(fā)酵階段的比生長率進行預(yù)估，再利用預(yù)估值進行發(fā)酵階段的在線辨識，并應(yīng)用于100L諾西肽發(fā)酵。依據(jù)辨識得到的發(fā)酵階段為0~13h為延遲期, 13~38 h為指數(shù)生長期,38 h以后為穩(wěn)定期。該結(jié)果與實際過程相一致。這種估計方法無延遲,非常適合在線應(yīng)用[8]。

間歇發(fā)酵放罐時機的準(zhǔn)確識別對提高產(chǎn)量和產(chǎn)率，降低能耗和成本有實際意義。傅春生等利用在線檢測的尾氣CO2變化率、DO變化率，輔以離線檢測的總糖濃度變化率、氨基氮濃度變化率及pH，并根據(jù)某抗生素生產(chǎn)數(shù)據(jù)，建立了該發(fā)酵過程放罐時機識別與預(yù)報模型及計算機實時識別系統(tǒng)。5批實驗表明模型判斷比人工更及時，且模型判斷的產(chǎn)量對于發(fā)酵終點的相對值高于人工判斷[9]。

安居白等依據(jù)尾氣CO2、O2及DO等在線參數(shù),運用Bayes數(shù)據(jù)融合計算菌體生長狀態(tài)概率，建立了在線識別菌體生長狀態(tài)的檸檬酸發(fā)酵控制專家系統(tǒng)，在1.5 m3試驗罐上提高產(chǎn)物對底物的比近十個百分點[10]。

2 優(yōu)化供氧

對于好氧發(fā)酵，為確保生產(chǎn)菌獲得適量的溶氧，將溶氧控制在臨界氧濃度之上即可。這樣既避免了細(xì)胞因供氧不足發(fā)生代謝異常，也可避免過度供氧引起的能量消耗和對細(xì)胞可能的傷害。根據(jù)OUR的變化可以很方便確定臨界氧濃度。其原理是：當(dāng)發(fā)酵罐在一定操作系統(tǒng)下，體積傳氧系數(shù)Kla保持恒定時，隨著OUR上升，DO呈下降趨勢，當(dāng)OUR下降，則DO上升，OUR與DO存在相反的變化趨勢。而當(dāng)DO降到臨界氧濃度以下時，OUR隨DO的下降而下降。由于發(fā)生在此變化的時間內(nèi)，菌體濃度變化可忽略，OUR的變化可看做是呼吸強度（即比耗氧速率）的變化。所以如果存在OUR與DO變化一致的階段，即為溶解氧低于臨界值的階段，從而可確定此時的臨界氧水平。

戴劍漉等在30L發(fā)酵罐上研究了必特螺旋霉素基因工程菌發(fā)酵中OUR、CER及DO等參數(shù)變化的相關(guān)性，發(fā)現(xiàn)當(dāng)DO與OUR的趨勢具有相反性時,限制因素為細(xì)胞水平的菌體代謝問題；若DO與OUR的趨勢具有同一性, 限制性因素為工程水平的氧傳遞因素,表明溶氧處于臨界氧以下；并據(jù)此判斷發(fā)酵前期臨界氧濃度應(yīng)在25%，為其發(fā)酵放大工藝研究提供了依據(jù)[11]。

通氣量的調(diào)節(jié)很多是憑借經(jīng)驗。在安裝溶氧電極時可根據(jù)臨界氧來調(diào)控。諶頡在阿維菌素發(fā)酵中用尾氣數(shù)據(jù)進行通氣量控制，發(fā)現(xiàn)在產(chǎn)素期當(dāng)通氣量由1600 m3/h降到1400 m3/h時,CER、OUR立即開始下降,RQ則是先升后降，說明供氧對代謝的限制已經(jīng)顯現(xiàn)。后來測定的產(chǎn)素速率也在此時下降。以此確定產(chǎn)素期通氣量臨界值為1600 m3/h[12]。

3 指導(dǎo)流加補料

流加發(fā)酵可在系統(tǒng)中維持很低的基質(zhì)濃度，從而避免發(fā)生阻遏效應(yīng)，并按設(shè)備能力維持適當(dāng)供氧，減緩代謝有害物的不利影響。因而可對發(fā)酵過程進行控制，提高生產(chǎn)水平。利用尾氣在線檢測分析可以合理控制流加時間、流加速率，進而實現(xiàn)流加的反饋控制。

   Cooney曾基于CO2總釋放量的積分，推導(dǎo)出極ng確的菌體量，據(jù)此來控制糖的流加速率[13]。

陳冠勝等根據(jù)多批青霉素生產(chǎn)測得的CER, 采用模糊控制技術(shù)，在青霉素生產(chǎn)期將CER作為控制參數(shù)進行補糖。該控制算法能針對菌絲的瞬間代謝情況流加糖，使菌絲對糖的利用能力大大加強，效率提高了10%左右[14]。

   固定化酵母發(fā)酵中，載體的存在使葡萄糖擴散受阻。如不能對糖濃度變化快速反應(yīng)，載體中的細(xì)胞就會出現(xiàn)缺糖現(xiàn)象。這種體系的特殊性也很難用估計糖濃度的方法來進行預(yù)測。潘小飛利用CER和CO2釋放量來估計載體內(nèi)菌體對糖的饑飽程度，從而控制葡萄糖流加速率，使乙醇連續(xù)平穩(wěn)地生產(chǎn)，平均轉(zhuǎn)化率為0.42g乙醇/g葡萄糖[15]。

4  生物量預(yù)測及預(yù)估

CER是呼吸代謝參數(shù)，與生物生長有密切聯(lián)系，可用來估計生物質(zhì)濃度和產(chǎn)物濃度。而且這種估計的是反應(yīng)活性生物質(zhì)濃度或產(chǎn)物濃度，排除了培養(yǎng)基固體成分和死細(xì)胞的干擾。K Gbewonyo等人在800 L反應(yīng)器上,曾研究利用在線的CER數(shù)據(jù)估計前期的菌體生長量,并且取得良好的對應(yīng)關(guān)系[16]. 姜長洪等在50 m3谷氨酸發(fā)酵罐上利用CER在線估算菌體量,并用實測數(shù)據(jù)進行校正,使估算值接近實際值,同時運用先進的過程控制策略,對谷氨酸發(fā)酵的主要參數(shù)進行控制，運行后糖酸轉(zhuǎn)化率穩(wěn)定提高,產(chǎn)酸率提高1.5%[17]。

Horiuchi等在大腸桿菌分批培養(yǎng)中，用尾氣CO2來估算細(xì)胞、葡萄糖、乙酸的濃度和比生長速率[18]。

桑海峰等基于在線檢測OUR，提出了一種比生長率與生物量濃度的在線連續(xù)估計方法。在諾西肽發(fā)酵應(yīng)用中,估計值與實驗值吻合度好[19]。

固態(tài)發(fā)酵已廣泛應(yīng)用于生物農(nóng)藥、飼料等行業(yè)，但生物量的測定是面臨的問題。在液態(tài)發(fā)酵容易做到的生物量離線測定，在此也因無法使菌體與培養(yǎng)基分離難以獲得。利用CO2在線檢測是比較有效的方法。張潔等人在木霉T6固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)淀粉酶及產(chǎn)木聚糖酶中，分別研究了CO2與淀粉酶及木聚糖酶活力的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)尾氣中CO2濃度曲線與比淀粉酶活力曲線變化一致，且同時達(dá)到Zda值；而木聚糖酶的合成與CO2含量之間存在滯后關(guān)系, CO2濃度在發(fā)酵26h達(dá)到Z高值,木聚糖酶活力在39h才達(dá)峰值。說明尾氣CO2含量變化可以作為固態(tài)發(fā)酵某些產(chǎn)物合成的研究參數(shù)[20-21]。

5 作為研究優(yōu)化發(fā)酵工藝的手段

   尾氣檢測分析目前已經(jīng)成為優(yōu)化發(fā)酵工藝非常有效的手段。

莊英萍等在50L發(fā)酵罐上進行梅嶺霉素的發(fā)酵過程研究，通過對OUR、CER、RQ及氧傳遞系數(shù)等進行在線檢測及相關(guān)分析，對原工藝不斷調(diào)整，實現(xiàn)了梅嶺霉素發(fā)酵的初步優(yōu)化，使發(fā)酵效價從原來的150 u/ml提高到520u/ml,為實現(xiàn)其工業(yè)化規(guī)模生產(chǎn)奠定了基礎(chǔ)[22]。

   朱校適等在50L發(fā)酵罐上進行了克拉維酸發(fā)酵過程溫度控制優(yōu)化試驗，分別將全程溫度控制在24℃、26℃、28℃。通過對發(fā)酵各階段的CER、OUR和RQ進行對比分析,發(fā)現(xiàn)溫度對棒狀鏈霉菌的生長和代謝有重要影響,降低對數(shù)生長期發(fā)酵溫度可明顯緩解前期供氧不足的矛盾，進而提出了發(fā)酵過程的變溫控制,使克拉維酸的產(chǎn)量由原來3950mg/L提高到4500mg/L,增產(chǎn)11.5%[23]。

在谷氨酸發(fā)酵中，控制CO2固定反應(yīng)與乙醛酸循環(huán)的比率，對谷氨酸的產(chǎn)率影響尤為關(guān)鍵。楊玉嶺等人試驗合理控制CO2排放量, 使CO2含量處于既維持菌體正常呼吸,又確保更多的CO2固定, 從而提高發(fā)酵轉(zhuǎn)化率。試驗結(jié)果，6m3罐將CO2控制在7~8%比不控制提高轉(zhuǎn)化率1.81%；75 m3罐控制在8~9%，提高轉(zhuǎn)化率1.4%[24]。

6故障預(yù)判

發(fā)酵過程周期長，投入大。特別是對于工業(yè)發(fā)酵，可以通過尾氣在線檢測參數(shù)較早發(fā)現(xiàn)異常，及時補救，將損失降至Zdi。

諶頡在阿維菌素發(fā)酵中發(fā)現(xiàn)非正常批次OUR的特征：OUR明顯偏高，菌體快速生長階段出現(xiàn)的OUR峰值超過對照批次約25%，且在100 h前數(shù)值基本都高于正常批次20 mol/m3.h。而非正常批次的產(chǎn)素速率僅為對照批次的50%左右。這是由于呼吸強度過高,菌體初級代謝過旺,雖用于合成的原料增加,但出于競爭關(guān)系,Z后進入合成途徑的反而減少,甚至因為初級代謝物的阻遏作用而完全YZ合成途徑，所以造成產(chǎn)素速率低下。這樣就可以通過前期的OUR及時發(fā)現(xiàn)問題，進行補救[25]。

董傳亮等采用OUR、CER、轉(zhuǎn)速、氨水耗量及細(xì)胞濃度，構(gòu)建成基于自我聯(lián)想神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)5-6-2-6-5的AANN網(wǎng)絡(luò)，進行故障診斷和故障處理，優(yōu)化得到的AANN網(wǎng)絡(luò)可以對谷氨酸發(fā)酵進行及時、準(zhǔn)確的故障預(yù)判，從而為排除故障、盡可能快地恢復(fù)發(fā)酵性能提供信息[26]。

7幫助判斷是否染菌

在線檢測CO2可以監(jiān)視發(fā)酵過程是否染菌。姜長洪等對谷氨酸發(fā)酵過程的研究發(fā)現(xiàn)，在正常通風(fēng)情況下,若CO2濃度迅速下降,說明發(fā)酵罐內(nèi)污染了噬菌體；若CO2濃度不斷上升,超出正常規(guī)律,則有可能污染了雜菌[27]。

8 結(jié)束語

綜上所述，尾氣分析技術(shù)在發(fā)酵領(lǐng)域應(yīng)用取得了可喜成就，相信隨著技術(shù)的進步，相關(guān)設(shè)備的普及，應(yīng)用研究會更加深入，并進一步推動生物產(chǎn)業(yè)發(fā)展。

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作者簡介：

劉仲匯, 女，高級工程師，山東省科學(xué)院生物研究所,山東省生物傳感器ZD實驗室，研究方向：發(fā)酵過程檢測、優(yōu)化與控制。通訊地址：濟南市歷下區(qū)科院路19號，山東省科學(xué)院生物研究所，電話：18653128916； E－mail: sws2605384@yahoo.com.cn，      scgy@sads.org