在前幾期，我們重 點(diǎn)為大家介紹并推薦了適用于中藥配方顆粒檢測(cè)的各類安捷倫色譜柱，以便大家在日后的檢測(cè)工作中匹配使用。本期繼續(xù)帶來適用于王不留行和炒王不留行配方顆粒檢測(cè)的色譜柱推薦，跟上我們，精彩繼續(xù)！

Agilent Polaris 系列色譜柱通過極性改性，增強(qiáng)了鍵合相與水的兼容性，同時(shí)避免次級(jí)作用的影響。通過極性封端(Polaris C18-A,C8-A,C18-ether,C8-ether)或者極性包埋(Polaris Amide-C18)，Polaris 系列色譜柱可與 100% 水相兼容。由于極性修飾的作用，Polaris 系列色譜柱具有特殊的選擇性。

在國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)中，王不留行和炒王不留行配方顆粒的檢測(cè)項(xiàng)目中，對(duì)特征譜圖和含量測(cè)定都采用 HPLC 方法。特征譜圖指定使用 ZORBAX Eclipse XDB C18 4.6x250mm, 5μm 色譜柱，含量測(cè)定也使用 HPLC 色譜柱。其中含量測(cè)定中系統(tǒng)適用性要求王不留行黃酮苷峰的理論板數(shù)按應(yīng)不低于 3000。本文采用 ZORBAX Eclipse XDB C18 色譜柱對(duì)特特圖譜進(jìn)行了重現(xiàn)，選用 Polaris C18-A 色譜柱用于含量測(cè)定。并采用 ZORBAX 的超高效色譜柱進(jìn)行了 UHPLC 方法轉(zhuǎn)換，提高分析效率。

特征譜圖

1.1 王不留行實(shí)驗(yàn)結(jié)果

圖 1. 王不留行配方顆粒標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照譜圖與方法重現(xiàn)供試品特征譜圖(包括標(biāo)準(zhǔn)方法和 UHPLC 方法)的比較 （峰 3(S):王不留行黃酮苷）

色譜條件：

標(biāo)準(zhǔn)方法：

?流動(dòng)相：A：乙腈；B：H2O（0.1%磷酸）

?梯度：0-35 min，95 %-80%B；35-60 min，80%B-40%B；后運(yùn)行，10min

?流速：1ml/min

?柱溫：30 °C

?檢測(cè)波長(zhǎng)：270 nm(4nm), Ref: off; 采樣頻率：2.5Hz

?進(jìn)樣量：10 μL

UHPLC 方法：

?梯度：0-5 min，95 %-80%B；5-9 min，80%B-40%B；后運(yùn)行，3min

?流速：0.6ml/min

?檢測(cè)波長(zhǎng)：270 nm(4nm), Ref: off; 采樣頻率：20Hz

?進(jìn)樣量：1 μL

?其余同上。

系統(tǒng)適用性結(jié)果見下表：

1.2 炒王不留行實(shí)驗(yàn)結(jié)果

色譜條件：

同王不留行。

系統(tǒng)適用性結(jié)果見下表：

結(jié)果

1）使用 ZORBAX Eclipse XDB C18 柱，重現(xiàn)王不留行和炒王不留行標(biāo)準(zhǔn)方法，所有特征峰均能準(zhǔn)確定位，且相對(duì)保留時(shí)間（RRT）完全符合標(biāo)準(zhǔn)要求。

2）UHPLC 方法中，王不留行環(huán)肽 B 的峰稍微提前，但通過標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照定位，綜合研判，可符合標(biāo)準(zhǔn)要求。

3） UHPLC 方法可使分析時(shí)間縮短至原來的 15%。

含量測(cè)定

2.1 王不留行實(shí)驗(yàn)結(jié)果

圖 2.供試品含量測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)方法和 UHPLC 方法譜圖對(duì)照

色譜條件：

標(biāo)準(zhǔn)方法：

?流動(dòng)相：A：乙腈；B：H2O（0.3%磷酸）

?梯度：0-10 min，65 %-65%B；10-20 min，65%B-60%B；20-35 min，60%B-60%B；后運(yùn)行，10min

?流速：1ml/min

?柱溫：35 °C

?檢測(cè)波長(zhǎng)：280 nm(4nm), Ref: off; 采樣頻率：2.5Hz

?進(jìn)樣量：10 μL

UHPLC 方法：

?梯度：0-2.1 min，65 %-65%B；2.1-4.2 min，65%B-60%B，4.2-7.4 min，60%B-60%B；后運(yùn)行，10min

?流速：0.4ml/min

?檢測(cè)波長(zhǎng)：280 nm(4nm), Ref: off; 采樣頻率：20Hz

?進(jìn)樣量：1 μL

 系統(tǒng)適用性結(jié)果見下表：

結(jié)果

1）選擇 Polaris C18-A 色譜柱，可以滿足含量測(cè)定系統(tǒng)適用性中理論板數(shù)要求(N>3000)。

2）由于存在溶劑效應(yīng)，實(shí)驗(yàn)中在自動(dòng)進(jìn)樣器和柱溫箱之間使用一段溶劑效應(yīng)消除管線，可以進(jìn)一步提高 HPLC 方法中的理論板數(shù)（接近于 4000），有利于提高分析方法的耐用性。

3） UHPLC 方法使用 Zorbax RRHD SB-Aq 柱，可以滿足系統(tǒng)適用性要求，并提高分析效率。

實(shí)驗(yàn)結(jié)論 .

本實(shí)驗(yàn)選用 ZORBAX Eclipse XDB C18 色譜柱對(duì)王不留行和炒王不留行配方顆粒特征譜圖進(jìn)行重現(xiàn)，均符合標(biāo)準(zhǔn)要求。特征圖譜方法轉(zhuǎn)換成 UHPLC 方法后，有利于分析效率提升。含量測(cè)定中，使用 Polaris C18-A 有利于滿足系統(tǒng)適用性對(duì)理論板數(shù)的要求，必要時(shí)增加溶劑效應(yīng)消除管線，進(jìn)一步提高理論塔板數(shù)。

儀器系統(tǒng)及色譜柱推薦

1260 Infinity II 四元 HPLC 系統(tǒng)：四元泵 (G7111B)，自動(dòng)進(jìn)樣器 (G7129A)，柱溫箱 (G7116A)，VWD (G7114A)

1290 Infinity II 四元 UHPLC 系統(tǒng)：全能泵(G7104A)，自動(dòng)進(jìn)樣器（G7129B），柱溫箱(G7116B)，DAD(G7117A)

其它詳細(xì)操作可以參考 Agilent 配方顆粒圖譜集