使用方法

Hieff Canace^® Uracil+ High-Fidelity DNA polymerase與常規(guī)高保真酶的使用方法略有不同。在使用前，請務(wù)必仔細閱讀使用說明。

1. 推薦反應(yīng)體系

所有操作應(yīng)于冰上進行，2×Canace^® Uracil+ PCR buffer解凍后請充分混勻。體系配置之前請預(yù)熱PCR儀，各組分添加完成之后用移液器吸打充分混勻并短暫離心至管底，然后置于預(yù)熱的PCR儀中進行反應(yīng)。所有組份使用完畢之后及時放回-20 °C保存。

表1. PCR擴增反應(yīng)體系

【注】：

1) 模板：使用純化后的高質(zhì)量DNA模板可以顯著提高擴增效率和成功率。

2) dNTPs：反應(yīng)體系中dNTPs使用終濃度為200 μM。試劑盒中提供的dNTPs中不含dUTP，如特殊情況下需要制備含dUTP的模板，可自行額外添加dUTP至終濃度為400 μM。

3) 聚合酶濃度：在50 μL體系中，推薦使用1 U，可以在0.5-2 U之間進行優(yōu)化，請勿超過2 U。為了防止聚合酶因3’→5’外切酶活性降解引物，建議將聚合酶在最后一步加到反應(yīng)體系中。

4) Mg²⁺終濃度：反應(yīng)體系中Mg²⁺終濃度為2 mM。如有特殊需要，可向我公司咨詢，要求提供低Mg²⁺濃度或不含Mg²⁺的buffer。

2．推薦反應(yīng)程序

表2. PCR擴增反應(yīng)程序

【注】：

1)預(yù)變性溫度推薦使用98°C。預(yù)變性推薦時間：質(zhì)粒DNA等簡單模板為30 sec；文庫為1 min；cDNA、基因組DNA等復(fù)雜模板為3 min；高GC含量模板為5-10 min。

2) 退火溫度推薦使用60°C，也可根據(jù)需要，設(shè)立溫度梯度去摸索引物退火的最適溫度。推薦退火時間為20 sec，可以在10-30 sec內(nèi)調(diào)節(jié)。退火時間太長可能導(dǎo)致擴增產(chǎn)物在膠上呈彌散狀。

3) 延伸溫度和時間：推薦使用72°C，延伸時間根據(jù)實際需要進行調(diào)整。

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