2023年11月16日，Vertex Pharmaceuticals和CRISPR Therapeutics共同宣布基因編輯療法產(chǎn)品CASGEVY™（Exagaglogene autotemcel）獲英國藥品監(jiān)管機構(gòu)MHRA有條件批準(zhǔn)上市，用于治療治療鐮狀細胞?。⊿CD）和輸血依賴性β-地中海貧血（TDT），是全球首款獲批上市的CRISPR基因編輯藥物，12月8日，美國食品和藥物管理局（FDA）也批準(zhǔn)了該基因編輯治療藥物。這是基因編輯治療歷史上的里程碑事件，代表著一項重大的科學(xué)進步可以讓數(shù)以萬計的患者受益。

圖1. CASGEVY™治療流程（Source：CRISPR Therapeutics官網(wǎng)）

自2012年首次亮相以來，CRISPR技術(shù)已在基因功能研究、藥物靶點篩選、遺傳疾病治療、癌癥研究以及作物育種等多個領(lǐng)域取得突破性成果。其工作機制如下：

Cas蛋白（如常用的Cas9）在gRNA的引導(dǎo)下定位到目標(biāo)DNA序列，隨后Cas9與DNA結(jié)合并切割其雙鏈，產(chǎn)生一個雙鏈斷裂（DSB）。細胞為了修復(fù)這一斷裂，將啟動自身的修復(fù)機制，如非同源末端連接（NHEJ）或同源重組修復(fù)（HDR）。通過這些修復(fù)過程，可以在目標(biāo)DNA中引入特定的序列。

目前CRISPR技術(shù)能以前所未有的精確度對DNA進行修改，包括添加、刪除或替換特定基因片段，這一進步不僅使基因修復(fù)更加便捷和精準(zhǔn)，也為基因治療指明了新的發(fā)展方向?；贑RISPR技術(shù)的基因治療主要分為體外和體內(nèi)兩種形式，下面將為大家詳細介紹。

圖2. 體外與體內(nèi)基因編輯療法^[1]

體外CRISPR基因編輯療法主要包括從患者身上收集細胞、在體外進行進行CRISPR基因編輯、將編輯后的細胞移植回患者體內(nèi)等流程，上述介紹的CASGEVY™便是典型的體外CRISPR基因編輯療法。除了直接利用CRISPR技術(shù)糾正導(dǎo)致癌癥的基因突變外，該技術(shù)在癌癥治療領(lǐng)域的另一關(guān)鍵應(yīng)用是免疫細胞的工程化改造，如創(chuàng)建嵌合抗原受體T細胞（CAR-T）、通用型CAR-T（UCAR-T）等抗癌免疫療法。

CAR-T療法是通過改造患者自體T細胞，使T細胞表面表達針對特定癌癥抗原的嵌合抗原受體（CAR），通過CAR特異性識別體內(nèi)腫瘤細胞，并釋放大量的多種效應(yīng)因子，高效地殺滅腫瘤細胞。然而，CAR-T療法在實際應(yīng)用中仍面臨一些挑戰(zhàn)，包括較長的制備周期、自體T細胞質(zhì)量的不穩(wěn)定性以及相對較高的治療成本，這些因素限制了其更廣泛的應(yīng)用。

圖3. CAR-T療法流程圖^[2]

為了突破傳統(tǒng)CAR-T療法的限制，UCAR-T療法，即通用型CAR-T或異體CAR-T應(yīng)運而生。這種療法使用健康捐獻者的T細胞作為原料，通過病毒載體等技術(shù)將CAR基因?qū)隩細胞，并運用基因編輯技術(shù)去除T細胞表面的TCR、HLA或CD52等分子，以預(yù)防供體T細胞引發(fā)的移植物抗宿主病（GvHD）并降低患者對異體細胞的排異反應(yīng)（HvGR）。經(jīng)過這一系列精細的改造和擴增過程，UCAR-T細胞被制備成可用于治療患者的成熟產(chǎn)品。

圖4. UCAR-T療法流程^[3]

UCAR-T療法流程：

CRISPR基因編輯的體外療法涉及從患者體內(nèi)提取細胞，在實驗室環(huán)境中進行基因修改，然后將經(jīng)過編輯的細胞重新輸回患者等過程。這種方法適用于某些關(guān)鍵類型的細胞，如造血干細胞（HSC），但并不適用于所有種類的細胞。另一種基因編輯療法是直接在體內(nèi)進行的基因編輯，無需細胞提取和體外操作的步驟，可直接在患者的體內(nèi)進行基因編輯。這種方法易于批量生產(chǎn)，給藥方式簡單，能顯著降低治療成本，還能為難以進行細胞提取或體外培養(yǎng)的疾病提供治療可能。

體內(nèi)基因編輯療法主要通過將基因編輯工具直接輸送至患者體內(nèi)，在體內(nèi)環(huán)境中對引發(fā)疾病的特定基因進行精確且有效的修改。目前已用于體內(nèi)基因編輯治療的基因編輯工具有3類：核酸酶（Nucleases）、堿基編輯器（Base editors）及先導(dǎo)編輯器（Prime editors）。

圖5. 體內(nèi)基因編輯療法原理圖^[4]

在哺乳動物細胞中，通常利用核酸酶在基因組DNA的特定位置引入DSB實現(xiàn)有效的基因編輯，其中，CRISPR-Cas核酸酶系統(tǒng)因其高效性和精確性而成為創(chuàng)建定向DSB最廣泛的應(yīng)用工具。CRISPR-Cas核酸酶系統(tǒng)體內(nèi)基因編輯流程如下：

圖6. 核酸酶作用原理圖^[1]

來源于化膿性鏈球菌（Streptococcus pyogenes）的SpCas9蛋白是目前最為常用的一種Cas蛋白，然而，由于SpCas9潛在的脫靶效應(yīng)和尺寸限制等問題，研究人員持續(xù)探索其他類型的Cas蛋白，如Cas12和Cas13，以期找到更小、更精確的Cas蛋白。同時，通過蛋白質(zhì)工程技術(shù)對Cas蛋白進行改造也是當(dāng)前研究的重點之一。這些改造旨在提高基因編輯的效率、減少脫靶率并優(yōu)化編輯窗口，從而進一步擴展CRISPR技術(shù)在基因治療等領(lǐng)域的應(yīng)用潛力。

目前CRISPR基因編輯技術(shù)仍處于高速發(fā)展階段，整個行業(yè)尚未完全成熟，隨著技術(shù)的不斷進步，預(yù)計會有更多的遞送技術(shù)得到改進，新的傳遞工具也將誕生，從而進一步提高治療的安全性和效果。體外CRISPR基因編輯療法已上市，相信體內(nèi)療法也會在不久的將來問世。