質(zhì)粒是一類(lèi)小的、雙鏈環(huán)裝DNA分子，攜帶染色體以外的遺傳信息，由于具有自我復(fù)制功能，被廣泛應(yīng)用于生物制藥領(lǐng)域。在細(xì)胞基因治 療產(chǎn)品中，質(zhì)粒是構(gòu)建病毒載體及目標(biāo)基因轉(zhuǎn)入的關(guān)鍵傳遞載體。在治 療或預(yù)防性藥物中，質(zhì)粒又可以作為終產(chǎn)品注入人體內(nèi)，進(jìn)行目標(biāo)蛋白的表達(dá)。早在2017年，全 球范圍內(nèi)以裸質(zhì)粒型基因治 療藥物的臨床方案（包含DNA疫苗）就達(dá)到了428個(gè)，隨著臨床成功的級(jí)別不斷提升，以及產(chǎn)品在進(jìn)入后期臨床研究階段上的進(jìn)步，行業(yè)對(duì)質(zhì)粒DNA的需求量不斷上升。相應(yīng)的，對(duì)于質(zhì)粒DNA的生產(chǎn)和質(zhì)控也提出了更高的要求。

       質(zhì)粒DNA的生產(chǎn)包括一系列的工藝步驟，為了確保質(zhì)粒制備的適宜條件，需要前期開(kāi)展大量的條件摸索，包括大腸桿菌的培養(yǎng)條件優(yōu)化。實(shí)驗(yàn)室規(guī)模的大腸桿菌培養(yǎng)有很多局限性，特別是缺少培養(yǎng)過(guò)程監(jiān)控，導(dǎo)致過(guò)程參數(shù)無(wú)法被實(shí)時(shí)控制。目前，實(shí)驗(yàn)室規(guī)模的大腸桿菌培養(yǎng)更多采用搖瓶培養(yǎng)這種終點(diǎn)檢測(cè)法，這對(duì)深入理解并優(yōu)化工藝參數(shù)是十分不利的。后續(xù)工業(yè)化生產(chǎn)不僅要求高產(chǎn)量，而且對(duì)質(zhì)粒的質(zhì)量（如超螺旋百分比）、生產(chǎn)成本以及工藝可放大性提出了更高的要求。而這一切的基礎(chǔ)就是對(duì)培養(yǎng)過(guò)程的深入理解與優(yōu)化。丹納赫生命科學(xué)旗下貝克曼庫(kù)爾特生命科學(xué)的BioLector Pro微流控高通量微型生物反應(yīng)器，可以在微孔板上進(jìn)行完整的生物工藝控制，它采用一次性48位微孔板，具有在線測(cè)量生物量、熒光、pH和溶氧值(DO) 等數(shù)據(jù)的功能，同時(shí)還能通過(guò)微閥控制器和微流控通道控制 pH 和補(bǔ)料速率，很好地解決傳統(tǒng)搖瓶及生物反應(yīng)罐通量低、費(fèi)時(shí)費(fèi)力費(fèi)原料或發(fā)酵過(guò)程為暗箱的難題，并可成功放大到1L和20L攪拌式生物反應(yīng)器上。

BioLector Pro 

微流控高通量微型生物反應(yīng)器

BioLector Pro – 大腸桿菌補(bǔ)料

發(fā)酵WR培養(yǎng)基，37℃，800 rpm，pH值=6.4，單向pH控制 (NaOH)，補(bǔ)料速率=5L/h 葡萄糖(500 g/L)，5h后開(kāi)始補(bǔ)料梅花板 (FlowerPlate)

       在實(shí)驗(yàn)室階段的菌液的收集可采用離心機(jī)來(lái)完成。在離心過(guò)程中，對(duì)于樣品的保護(hù)和提高回收效率是非常重要的，有些樣品在離心收集后，由于與離心管壁貼合不緊密，在轉(zhuǎn)子減速過(guò)程中很容易再次懸浮起來(lái)，造成沉淀的回收率降低。貝克曼庫(kù)爾特生命科學(xué)的 Avanti J-15R制冷型臺(tái)式高效離心機(jī)，內(nèi)置 Ultra Harmonic Technology (UHT) 超平穩(wěn)離心技術(shù)，能夠智能加減速，減少樣品擾動(dòng)重懸，實(shí)現(xiàn)樣品保護(hù)并提高回收得率。另外Avanti J-15R的轉(zhuǎn)頭可選配生物安全密封蓋及Aerosolve透明密封杯，防止氣溶膠污染。

       在質(zhì)粒DNA的GMP生產(chǎn)中，考慮到效率和放大的問(wèn)題，菌液的收集一般采用中空纖維或微濾膜包，然后采用一次性混合器Wandmixer進(jìn)行菌體堿裂解，接著采用大腸桿菌重組RNase來(lái)去除RNA?？紤]到成本問(wèn)題，一般是采用CaCl2絮凝及NH4HCO3沉淀的方式，通過(guò)深層過(guò)濾以及除 菌過(guò)濾得到澄清料液，從而進(jìn)行捕獲層析，然后結(jié)合產(chǎn)品的實(shí)際情況選擇不同的工藝進(jìn)行精制純化，此時(shí)會(huì)得到比較純的質(zhì)粒，接下來(lái)進(jìn)行超濾濃縮，制劑混合，Z 后進(jìn)行除 菌罐裝。丹納赫生命科學(xué)旗下Pall擁有從菌液收獲到除 菌過(guò)濾的質(zhì)粒純化及制劑混合和除 菌罐裝的方案。

       另外，在菌體裂解后，還可使用貝克曼庫(kù)爾特超速離心機(jī)搭配N(xiāo)VT 100/90/65 近垂直轉(zhuǎn)頭（k因子小，可大幅度縮短離心時(shí)間），采用CsCl密度梯度離心方法可實(shí)現(xiàn)mg級(jí)到g級(jí)無(wú)內(nèi)毒素超螺旋構(gòu)象質(zhì)粒的純化，大大提高后續(xù)轉(zhuǎn)染效率。

       目前，多種先進(jìn)技術(shù)已用于獲得大量純化的質(zhì)粒產(chǎn)品，相應(yīng)地安全性和符合監(jiān)管的要求也日臻完善，其中高質(zhì)量、高純度的超螺旋質(zhì)粒是確?；蛑苿┌踩院陀行缘那疤釛l件，也是質(zhì)粒檢測(cè)的關(guān)鍵質(zhì)量屬性。EMEA，F(xiàn)DA以及中國(guó)都對(duì)用于基因制劑的質(zhì)粒DNA中超螺旋百分比含量有一定的要求。

       使用丹納赫生命科學(xué)旗下SCIEX 的PA 800 Plus毛細(xì)管電泳制藥分析系統(tǒng)，結(jié)合激光誘導(dǎo)熒光檢測(cè)器（LIF）和dsDNA 1000 試劑盒，可以對(duì)質(zhì)粒的三種拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)進(jìn)行高效分離，并能準(zhǔn)確計(jì)算超螺旋百分比，用于質(zhì)粒的純度檢測(cè)。

       生物制藥的快速發(fā)展，促進(jìn)了行業(yè)對(duì)質(zhì)粒的需求增長(zhǎng)，丹納赫生命科學(xué)具有一系列從實(shí)驗(yàn)室研究到GMP生產(chǎn)的質(zhì)粒工藝及質(zhì)控方案，來(lái)滿足日益增長(zhǎng)的質(zhì)粒DNA生產(chǎn)的需要。