病毒載體包裝的實(shí)驗(yàn)流程主要包括質(zhì)粒制備、細(xì)胞培養(yǎng)、質(zhì)粒轉(zhuǎn)染、病毒收獲與純化四個(gè)核心階段。其中，質(zhì)粒轉(zhuǎn)染環(huán)節(jié)是消耗大量質(zhì)粒的關(guān)鍵步驟，其用量與包裝規(guī)模直接相關(guān)。

1.1質(zhì)粒類(lèi)型包含：

棄去培養(yǎng)液，PBS溶液輕輕洗滌細(xì)胞，以去除殘留的培養(yǎng)基和細(xì)胞碎片。使用1mL胰蛋白酶來(lái)消化細(xì)胞，使其從培養(yǎng)皿上脫落。消化完成后，用1mL完全培養(yǎng)基中終止消化，并調(diào)整細(xì)胞密度至每10毫升含有500萬(wàn)個(gè)細(xì)胞；將這些細(xì)胞重新接種到新的10厘米培養(yǎng)皿中培養(yǎng)，確保在轉(zhuǎn)染前細(xì)胞密度達(dá)到80%左右這個(gè)密度是轉(zhuǎn)染的最佳條件，可以提高轉(zhuǎn)染效率和病毒產(chǎn)量。

注意:在復(fù)蘇細(xì)胞后，需要傳代至少2次才能進(jìn)行病毒包裝實(shí)驗(yàn)。這是因?yàn)閺?fù)蘇后的細(xì)胞需要一定的時(shí)間來(lái)恢復(fù)其正常生理狀態(tài)。同時(shí)，傳達(dá)后的18-24小時(shí)內(nèi)，需要確保細(xì)胞密度達(dá)到80%左右，以便進(jìn)行后續(xù)的轉(zhuǎn)染操作。

轉(zhuǎn)染前1~2h 將需要轉(zhuǎn)染的細(xì)胞換新鮮的培養(yǎng)基，10mL/10cm皿，注意293T細(xì)胞的貼壁性不是很好，換液的時(shí)候盡量沿著側(cè)壁加液體。

慢病毒（Lentivirus）載體是以 HIV-1 （人類(lèi)免疫缺陷 1 型病毒）為基礎(chǔ)發(fā)展起來(lái)的基因治療載體。慢病毒具有感染譜廣泛、可以有效感染分裂期和靜止期細(xì)胞、長(zhǎng)期穩(wěn)定表達(dá)外源基因等優(yōu)點(diǎn)，因此成為導(dǎo)入外源基因的有力工具?，F(xiàn)在慢病毒系統(tǒng)已經(jīng)被廣泛應(yīng)用到各種細(xì)胞系的基因過(guò)表達(dá)、RNA 干擾、microRNA 研究以及活體動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中。

轉(zhuǎn)染后 48 h 和 72 h 分別兩次收集病毒上清（48 h 收集后置換新鮮培液）， 將收集的上清用 0.45 μm 濾器過(guò)濾，然后放于超速離心管中，4 ℃，72000 g 離心 120 min。

棄上清，500 μl 重懸液重懸病毒沉淀，一周內(nèi)使用則置于 4 ℃ 保存，如需長(zhǎng)時(shí)間存放需置于 -80 ℃ 或液氮罐保存。（注：具體重懸體積根據(jù)實(shí)驗(yàn)需求而定）。

在 96 孔板中鋪合適數(shù)量的 293T 細(xì)胞，第二天將慢病毒原液進(jìn)行梯度稀釋后分別感染 293T 細(xì)胞，感染 24 h 后換成無(wú)病毒的培養(yǎng)液，感染 72 h 后在熒光顯微鏡下觀察結(jié)果，對(duì)熒光比例合適（10 ~ 30% 之間）的孔進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。

滴度計(jì)算公式為：滴度（TU/ml）=細(xì)胞數(shù) ×熒光百分比×10³ / 病毒原液體積

核心結(jié)論：原代細(xì)胞、干細(xì)胞、免疫細(xì)胞和神經(jīng)細(xì)胞（如SH-SY5Y）是內(nèi)毒素敏感細(xì)胞系的代表，必須使用增強(qiáng)型去內(nèi)毒素質(zhì)粒大提，推薦翌圣超純無(wú)內(nèi)毒素質(zhì)粒大量提?。–at#19038ES）；而HEK293、HeLa等耐受細(xì)胞系可適當(dāng)放寬要求，仍建議使用高質(zhì)量質(zhì)粒。