實(shí)時(shí)熒光定量PCR （Quantitative Real-time PCR）是一種在DNA擴(kuò)增反應(yīng)中，以熒光化學(xué)物質(zhì)測(cè)每次聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）循環(huán)后產(chǎn)物總量的方法。通過(guò)內(nèi)參或者外參法對(duì)待測(cè)樣品中的特定DNA序列進(jìn)行定量分析的方法。下面就讓小編為你具體介紹一下。

實(shí)時(shí)熒光定量PCR

傳統(tǒng)定量只能終點(diǎn)檢測(cè)的局限通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)有效地解決了。每一輪循環(huán)均可檢測(cè)一次熒光信號(hào)的強(qiáng)度被實(shí)現(xiàn)了，并且在電腦軟件之中記錄，通過(guò)對(duì)每個(gè)樣品Ct值的計(jì)算，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線獲得定量結(jié)果。因而，實(shí)時(shí)熒光定量PCR之所以無(wú)需內(nèi)標(biāo)是因?yàn)槠浣⒃趦蓚€(gè)基礎(chǔ)之上的：

1）Ct值與起始模板的線性關(guān)系

因?yàn)镃t值與起始模板的對(duì)數(shù)存在線性關(guān)系，，能夠利用標(biāo)準(zhǔn)曲線定量測(cè)定未知樣品。所以，實(shí)時(shí)熒光定量PCR是一種采用外標(biāo)準(zhǔn)曲線定量的方法。

和內(nèi)標(biāo)法相比，外標(biāo)準(zhǔn)曲線的定量方法更科學(xué)，更準(zhǔn)確、更值得信賴。迄今為止，已得到全世界的公認(rèn)，定量Z準(zhǔn)確，重現(xiàn)性Z好的定量方法就是外標(biāo)準(zhǔn)曲線的實(shí)時(shí)熒光定量PCR。

2）Ct值的重現(xiàn)性

當(dāng)PCR循環(huán)在到達(dá)Ct值所在的循環(huán)數(shù)時(shí)，真正的指數(shù)擴(kuò)增期（對(duì)數(shù)期）剛剛進(jìn)入，這個(gè)時(shí)候，誤差尚未放大，仍很微小，所以

Ct值的重現(xiàn)性極好，也就是說(shuō)，無(wú)論是同一時(shí)間不同管內(nèi)擴(kuò)增，還是同一模板不同時(shí)間擴(kuò)增，得到的都是恒定的Ct值。

實(shí)時(shí)熒光定量PCR在基因表達(dá)研究、轉(zhuǎn)基因研究，藥物L(fēng)X考核、病原體檢測(cè)等諸多領(lǐng)域得到廣泛地應(yīng)用。

實(shí)時(shí)熒光定量PCR的定量方法

在Real-timePCR中，模板定量有相對(duì)定量和定量?jī)煞N策略。

優(yōu)勢(shì)

Ct值（限制點(diǎn)的循環(huán)數(shù)）指的是樣品到達(dá)域值水平所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)。為了使獲得的數(shù)據(jù)Z準(zhǔn)確，可重復(fù)，域值應(yīng)設(shè)定在使指數(shù)期的擴(kuò)增效率為Zda。若標(biāo)有相應(yīng)濃度的標(biāo)準(zhǔn)品同時(shí)擴(kuò)增，一條可以用來(lái)計(jì)算未知樣品的濃度的標(biāo)準(zhǔn)曲線將由線性回歸分析產(chǎn)生。

在“Torsch”診斷中的應(yīng)用

在妊娠早期（1-3個(gè)月），胎兒容易因?yàn)楦腥灸承┎≡⑸锒?，有弓體（TOX）、風(fēng)疹病毒（RV）、單純皰疹病毒（HSV）、沙眼衣原體（CT）、及巨細(xì)胞（HCMV）是這些病原體中Z常見(jiàn)的。對(duì)這幾種病原體的檢測(cè)按照它們的英文詞首簡(jiǎn)稱為Torsch試驗(yàn)。