定量PCR（即時聚合酶鏈鎖反應(yīng)，Real-time Polymerase Chain Reaction，簡稱 Real-time PCR、即時PCR），又稱定量即時聚合酶鏈鎖反應(yīng)（Quantitative real time polymerase chain reaction，簡稱 Q-PCR/qPCR/rt-qPCR、定量即時PCR、即時定量PCR），是一種在DNA擴增反應(yīng)中，以螢光染劑偵測每次聚合酶鏈鎖反應(yīng)（PCR）循環(huán)后產(chǎn)物總量的方法技術(shù)。下面就讓小編為你具體介紹一下吧。

一、傳統(tǒng)定量PCR方法

1）競爭法：

選擇由突變克隆產(chǎn)生的含有一個新內(nèi)切位點的外源競爭性模板。在同一反應(yīng)管中，用同一對引物同時擴增待測樣品與競爭模板。擴增后PCR產(chǎn)物用內(nèi)切酶消化。酶將競爭性模板的產(chǎn)物分解成兩個片段，而待測模板不被酶切，兩種產(chǎn)物可通過電泳或GX液相分開，對它們的熒光強度分別進行測定，未知模板的起始拷貝數(shù)據(jù)已知模板推測。

2）PCR－ELISA法：

利用地 高 辛或生物素等標(biāo)記引物，擴增產(chǎn)物被固相板上特異的探針?biāo)Y(jié)合，再加入抗地 高 辛或生物素酶標(biāo)抗體－辣根過氧化物酶結(jié)合物，Z終酶使底物顯色。常規(guī)的PCR－ELISA法只是定性實驗，若加入內(nèi)標(biāo)，作出標(biāo)準(zhǔn)曲線，也可實現(xiàn)定量檢測目的。

3）內(nèi)參照法：

將已定量的內(nèi)標(biāo)和引物加入到不同的PCR反應(yīng)管中，內(nèi)標(biāo)用基因工程方法合成。下游引物不標(biāo)記，上游引物用熒光標(biāo)記。在模板擴增的同時，內(nèi)標(biāo)也被擴增。在PCR產(chǎn)物中，因為靶模板的長度和內(nèi)標(biāo)不一樣，電泳或GX液相可以將二者的擴增分離開來，對它們的熒光強度分別測定，待檢測模板的定量是通過對照內(nèi)標(biāo)。

二、內(nèi)標(biāo)在傳統(tǒng)定量中的作用

因為PCR到達平臺期后進行檢測是傳統(tǒng)定量方法。但是PCR經(jīng)過對數(shù)期擴增到達平臺期時，具有很差的檢測重現(xiàn)性極差，所以起始模板量無法直接從終點產(chǎn)物量推算，將內(nèi)標(biāo)加入后，可以使得產(chǎn)物定量所造成的不準(zhǔn)確性部分消除。

三、內(nèi)標(biāo)對定量PCR的影響

若將已知起始拷貝數(shù)的內(nèi)標(biāo)加入到待測樣品中，那么PCR反應(yīng)變?yōu)殡p重PCR，雙重PCR反應(yīng)中存在兩種模板之間的干擾和競爭特別是兩種模板的起始拷貝數(shù)有比較大的差距時，會表現(xiàn)出更加明顯的競爭關(guān)系。然而因為待測樣品的起始拷貝數(shù)是未知的，所以無法加入合適數(shù)量的已知模板作為內(nèi)標(biāo)