熒光顯微鏡是光學(xué)顯微鏡的一種，是免疫熒光細(xì)胞化學(xué)的基本工具。以紫外線為光源，用以照射被檢物體，使之發(fā)出熒光，然后觀察物體的形狀及其所在位置。用于研究細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)的吸收、運輸、化學(xué)物質(zhì)的分布及定位等。

熒光顯微鏡的發(fā)展

　　自從1590年詹森父子發(fā)明顯微鏡以來，已有400多年的歷史。顯微鏡的發(fā)展一直是以提高圖像的對比度和分辨力為主要目標(biāo)。

　　熒光顯微鏡是以紫外光或藍(lán)紫單色光激發(fā)標(biāo)本來產(chǎn)生熒光，因為紫外光不可見，故由標(biāo)本發(fā)出的熒光與背景反差很大，即熒光顯微鏡通常在黑暗的背景下觀察彩色的圖像;而普通顯微鏡是在明亮的背景下觀察較暗的樣品。這樣熒光顯微鏡的對比度比普通顯微鏡提高約100倍，因此可觀察到普通顯微鏡下看不到的結(jié)構(gòu)細(xì)節(jié)。熒光顯微鏡具有對比度高這個突出的優(yōu)點，得到了廣泛的應(yīng)用。

熒光顯微鏡的類型

　　透射式熒光顯微鏡：

　　下圖(a)是透射式熒光顯微鏡的原理圖。由汞燈發(fā)出的各種譜線的光線，經(jīng)激發(fā)濾光片后只讓某一種波長的紫外光線通過，如波長為404.7nm藍(lán)紫光，經(jīng)反光鏡后，激發(fā)樣品產(chǎn)生熒光。這個濾光片將其它波長的光線濾掉，并使樣品激發(fā)熒光，所以稱激發(fā)濾光片。

　　通常，熒光波長比激發(fā)樣品的光的波長大得多，是可見光。這樣產(chǎn)生的熒光和透過樣品的一部分激發(fā)光(紫外光)，經(jīng)物鏡成像后，人眼即可用目鏡觀察熒光圖像。為了防止紫外光進(jìn)人目鏡視場，降低圖像材度和損傷人眼，安放了一塊截止濾光片，它只讓某一部分波長的譜線通過，如只讓500～750nm的可見光通過，而不讓500nm以下的光通過，所以稱為截止濾光片。

　　反射式熒光顯微鏡：

　　上圖(b)是反射式熒光顯微鏡的原理圖。反射式熒光顯微鏡和透射式熒光顯微鏡的原理類同。

　　反射式熒光顯微鏡有下列優(yōu)點：

　?、俟饽艿睦寐矢摺Ｔ诜瓷涫綗晒怙@微鏡中，激發(fā)光直接照射在標(biāo)本的觀察表面;而在透射式熒光顯微鏡中，激發(fā)光穿過具有一定厚度的標(biāo)本后才抵達(dá)觀察表面，能量被衰減。

　?、诜瓷涫綗晒怙@微鏡可以觀察不透明標(biāo)本。所以現(xiàn)在大多采用反射式熒光顯微鏡。然而，實現(xiàn)反射熒光的技術(shù)難度較高，此技術(shù)隨著電子計算機(jī)的出現(xiàn)，薄膜技術(shù)的不斷發(fā)展才得以實現(xiàn)。實際反射式熒光顯微鏡中，激發(fā)、截止濾光片和半透分光鏡是做成一個濾光片組。

熒光顯微鏡和普通顯微鏡的區(qū)別

　　熒光顯微鏡是通過使被測物體發(fā)出熒光，再通過觀察熒光的波長來對物體進(jìn)行研究的工具。雖然都是屬于顯微鏡的范疇，但是熒光顯微鏡從制造原理到觀察方法都要和普通的顯微鏡不同。

　　1、應(yīng)用領(lǐng)域

　　普通顯微鏡可以觀察多種不同領(lǐng)域里的產(chǎn)品，但是熒光顯微鏡就只能用于觀察生物細(xì)胞。它使用紫外線照射被測物質(zhì)，使其發(fā)出熒光，然后再對物質(zhì)進(jìn)行仔細(xì)的觀察和分析。

　　如果目標(biāo)無法發(fā)出熒光我們還可以用熒光燃料進(jìn)行染色，然后再進(jìn)行觀察。使用熒光的方法多是為了觀測一些特別細(xì)小的物質(zhì)，這些物質(zhì)通常不能被肉眼直接觀察。生物科學(xué)里經(jīng)常需要進(jìn)行觀察的細(xì)胞類物質(zhì)很難用肉眼觀察，所以熒光顯微鏡在生物細(xì)胞學(xué)中的應(yīng)用就會比較多。

　　2、紫外線觀測

　　普通顯微鏡利用自然光源進(jìn)行觀察，而熒光顯微鏡是通過紫外線進(jìn)行觀測。紫外線的波長較短，所以在做為觀察物體的光源時，可以得到比較高的分辨率。對于觀察細(xì)胞內(nèi)部的細(xì)胞壁和細(xì)胞核等具體結(jié)構(gòu)會有所幫助。

　　3、兩個濾光片

　　熒光顯微鏡有兩個濾光片，一個主要用來在使用前過濾可見光，減少觀測時的誤差。另外一個在物鏡和目鏡之間的濾鏡是為了過濾紫外線，用來保護(hù)研究人員的雙眼。紫外線畢竟是對人體有所損害的，不進(jìn)行紫外線的防護(hù)的話，會對眼睛造成嚴(yán)重的傷害。因為其它的顯微鏡無需對紫外線進(jìn)行防護(hù)，所以也不需要安裝這兩個過濾片。