熒光顯微鏡是利用特定波長的光，照射被檢物體產(chǎn)生熒光進行鏡檢的光學(xué)觀測儀器，已有100多年歷史。熒光顯微鏡是在復(fù)式顯微鏡上安裝熒光裝置集合而成，熒光裝置包括熒光光源、激發(fā)光光路、激發(fā)/發(fā)射濾光片組件等器件。

熒光顯微鏡工作原理

　　熒光顯微鏡是醫(yī)院科研、病理、檢驗等部門常用的醫(yī)用光學(xué)儀器之一。因為普通的顯微鏡是在明亮的背景上觀察暗物，而熒光顯微鏡是在暗背景下觀察彩色的圖像，因此它比普通的顯微鏡分辨力提高100倍，可以觀察到普通顯微鏡看不到的細(xì)節(jié)。但是它的調(diào)整，校正難度較高，只要解決了熒光顯微鏡的問題，其它顯微鏡問題就迎刃而解。

徠卡AF6000正置顯微鏡 適用于徠卡熒光顯微鏡和寬場顯微鏡的綜合應(yīng)用系統(tǒng)平臺

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　　下圖是熒光顯微鏡的光學(xué)系統(tǒng)圖。由汞燈發(fā)出的各種譜線的光線，經(jīng)激發(fā)濾光片后只讓某一種波長的紫外光線通過，如波長為404.7nm藍紫光，經(jīng)反光鏡后，激發(fā)樣品產(chǎn)生熒光。激發(fā)濾光片將其他波長的光線濾掉，并使樣品激發(fā)熒光，所以稱其為激發(fā)濾光片。通常，激發(fā)產(chǎn)生的熒光波長比激發(fā)樣品的光的波長大得多，是可見光。這樣產(chǎn)生的熒光和透過樣品的一部分激發(fā)光(紫外光)，經(jīng)物鏡成像后，人眼即可用目鏡觀察熒光圖像。為了防止紫外光進入目鏡視場，降低圖像襯度和損傷人眼，放置了一塊截止濾光片，它只讓某一部分波長的譜線通過，如只讓500～750nm的可見光通過，而不讓500nm以下的光通過。

　　從圖中可以看出，光源是熒光顯微鏡主要組成部分，熒光顯微鏡都采用200W的超高壓汞燈作光源。它是由石英玻璃制作，中間呈球形，內(nèi)充有一定量的汞，工作時在兩極間放電，引起水銀蒸發(fā)，球內(nèi)氣壓迅速升高，當(dāng)水銀完全蒸發(fā)時，可達50～70個標(biāo)準(zhǔn)大氣壓力，這一過程一般約5～15min。超高壓汞燈的發(fā)光是電極間放電使水銀分子在不斷解離和還原過程中發(fā)射光量子的結(jié)果。它發(fā)射很強的紫光，足以激發(fā)各類熒光物質(zhì)，因此被熒光顯微鏡普遍采用。

熒光顯微鏡的激發(fā)熒光方式

　　熒光顯微鏡是免疫熒光組織化學(xué)的基本工具。它是由超高壓光源、濾片系統(tǒng)(包括激發(fā)和壓制濾板)、光學(xué)系統(tǒng)和攝影系統(tǒng)等主要部件組成，是利用一定波長的光激發(fā)標(biāo)本發(fā)射熒光。

　　熒光顯微鏡激發(fā)熒光的方式：按光的波長范圍分為UV激發(fā)法(使用紫外線照明法)和BV激發(fā)法(使用藍紫光)兩種。

　　UV激發(fā)法是用短于400nm外光進行激發(fā)。該法不存在可見的激發(fā)光，所以被觀察的熒光呈現(xiàn)該染料固有的熒光，容易判別標(biāo)本上的特異熒光和背景組織的自身熒光。

　　BV激發(fā)法是以404nm、434nm為ZX的由紫外至藍光進行激發(fā)。該方法使用藍光照射標(biāo)本，所以熒光顯微鏡的截止濾光片必須使用可完全阻斷藍光并可充分通過所需綠、黃熒光的濾光片。用于熒光抗體法的熒光色素。對于激發(fā)光的極大吸收波長和熒光的極大發(fā)光波長比較接近，所以BV激發(fā)法使用的濾光片必須使用銳截止式濾光片。該法可用藍光作為激發(fā)光，所以熒光色素的吸收效率較高，可得到較明亮的圖像。其缺點是500nm以下的熒光無法看到，而500nm以上的使整個圖像顯黃色。在熒光抗體法中，大多以熒光色素特有的顏色來判斷其特異性，所以在討論微妙的特異性時，上述BV激發(fā)法的缺點往往影響極大。

　　綜上所述，熒光顯微鏡的照明可根據(jù)聚光器的構(gòu)造和激發(fā)光的波長按以下三點考慮。

　?、購臒晒庀竦姆床钜髞砜?，UV激發(fā)暗場聚光器照明Z好。

　?、谝韵竦牧炼葋砜紤]，BV激發(fā)濾光片暗場觀察效率Zgao。

　?、踀V激發(fā)濾光片暗場觀察和BV激發(fā)暗場聚光器照明的特性，可看作介于這兩種照明方法之間，但前者濾光片暗場的性質(zhì)較強，顯示圖像較明亮，反差小;后者因保留暗場光路的性質(zhì)，故顯示圖像較暗，而反差有所改善。當(dāng)實際使用熒光顯微鏡時，應(yīng)采用Z適合標(biāo)本要求的照明法進行觀察。

　　必須指出，即使像反差Z佳的UV激發(fā)暗場聚光器照明，由標(biāo)本折射或散射的部分紫外激發(fā)光也會進入物鏡，這樣在光學(xué)系統(tǒng)中的加拿大膠膠合面和光學(xué)玻璃因激發(fā)引起的自身熒光會使像的反應(yīng)變壞。因此，必須在目鏡前面使用紫外吸收濾光片作為截止濾光片。