熒光顯微鏡是以紫外線為光源，用以照射被檢物體，使之發(fā)出熒光，然后在顯微鏡下觀察物體的形狀及其所在位置。熒光顯微鏡用于研究細胞內(nèi)物質(zhì)的吸收、運輸、化學(xué)物質(zhì)的分布及定位等。

熒光顯微鏡的使用方法

　　1、用窗簾遮蔽光線，關(guān)閉房間內(nèi)的電燈，除去熒光顯微鏡的防塵罩，確保熒光顯微鏡燈室通風(fēng)良好、無遮蓋。裝上汞燈燈箱，并轉(zhuǎn)動燈箱卡圈上的撥桿，將燈箱與鏡臂連接。

　　2、將汞燈燈箱的電源插頭插入熒光電源箱后的插座，再將熒光電源箱的插頭插入220V外接電源。

　　3、打開熒光顯微鏡電源開關(guān)，電壓表顯示出電源電壓，如電源電壓波動不大于額定電壓值的5%，即可按下啟動開關(guān)點燃汞燈，如因天氣太冷或電壓不穩(wěn)定等原因，一次啟動未點燃汞燈，可以多按幾次。待超高壓汞燈弧光達到穩(wěn)定狀態(tài)并達到Zda發(fā)光效率，即可開始工作。

　　4、燈泡的調(diào)中：

　　①任選一塊標(biāo)本放在熒光顯微鏡載物臺上。

　　②轉(zhuǎn)動鏡臂上的聚光鏡旋鈕使聚光鏡移出光路，轉(zhuǎn)動濾色片組轉(zhuǎn)換手輪，將紫光(V)或藍光(B)或綠光(G)激發(fā)濾色片組轉(zhuǎn)入光路，并將25熒光物鏡轉(zhuǎn)入光路。

　?、壅{(diào)節(jié)粗微調(diào)手輪，將標(biāo)本像調(diào)焦清晰。

　?、芮昂笸苿哟怪闭彰髌饔疫叺木酃忡R調(diào)焦推桿，使視場光欄成像清晰，轉(zhuǎn)動視場光欄撥桿將視場光欄收小，調(diào)節(jié)視場光欄調(diào)中螺釘使視場光欄居中，然后再將視場光欄開至Zda。

　?、蒉D(zhuǎn)動鏡臂上的聚光鏡旋鈕使聚光鏡移入光路，前后調(diào)節(jié)燈箱上的聚光鏡撥桿，使汞燈的弧光在視場內(nèi)成像清晰。

　?、拚{(diào)整燈箱上的燈泡水平調(diào)節(jié)螺釘和垂直調(diào)節(jié)螺釘，使汞燈的弧光居中。

　?、哒{(diào)整反光鏡水平調(diào)節(jié)螺釘和垂直調(diào)節(jié)螺釘，使光源的反射像與汞燈的弧光分開。

　?、噢D(zhuǎn)動聚光鏡旋鈕把聚光鏡移出光路，此時視場照明均勻。

　　5、熒光觀察：

　?、賹晒馊旧珮?biāo)本放到熒光顯微鏡載物臺上。

　?、趯?0x平場物鏡或25x熒光物鏡轉(zhuǎn)入光路，調(diào)節(jié)載物臺縱橫移動手輪，將標(biāo)本移入光路。

　　③轉(zhuǎn)動濾光片轉(zhuǎn)換撥輪，將熒光染色標(biāo)本所需要的激發(fā)濾光片組轉(zhuǎn)入光路。激發(fā)濾光片組編號刻在濾片組轉(zhuǎn)換撥輪上。濾光片選擇正確與否，是熒光顯微鏡能否得到正確應(yīng)用的關(guān)鍵。選用濾光片時，必須遵守斯托克斯定律：激發(fā)濾光片的透射波長<雙色束分離器的透射波長<阻斷濾光片的透射波長。

　?、苷{(diào)節(jié)粗調(diào)手輪，當(dāng)看清熒光圖像輪廓后，再用微調(diào)手輪調(diào)焦，直至看到清晰的熒光圖像。

　　⑤當(dāng)需要得到較強的熒光圖像時，可轉(zhuǎn)動聚光鏡旋鈕把聚光鏡移入光路，可獲得較明亮的熒光圖像。

　?、蕻?dāng)需要使用40x或100x熒光物鏡觀察時，應(yīng)在標(biāo)本和物鏡間加上甘油，油中不能有影響觀察的小泡或雜質(zhì)。使用時可使甘油慢慢浸潤一會兒，然后輕輕左右來回轉(zhuǎn)動物鏡轉(zhuǎn)換器以排除氣泡。

　　6、熒光顯微攝影

　　由于熒光圖像一般均較明場觀察暗得多，所以進行熒光顯微攝影需要較長的曝光時間，在曝光時應(yīng)注意避免熒光顯微鏡震動。為了縮短曝光時間，可選擇倍率較低的攝影目鏡或感光度較高的攝影膠片如ASA200以上或DIN24以上。

　　熒光顯微鏡攝影技術(shù)對于記錄熒光圖像十分必要，由于熒光很易褪色減弱，要即時攝影記錄結(jié)果。方法與普通顯微攝影技術(shù)基本相同。因紫外光對熒光猝滅作用大，如FITC的標(biāo)記物，在紫外光下照射30s，熒光亮度降低50%。所以，曝光速度太慢，就不能將熒光圖像拍攝下來。一般研究型熒光顯微鏡都有半自動或全自動顯微攝影系統(tǒng)裝置。

　　7、熒光圖像的記錄方法

　　熒光顯微鏡所看到的熒光圖像，一是具有形態(tài)學(xué)特征，二是具有熒光的顏色和亮度，在判斷結(jié)果時，必須將二者結(jié)合起來綜合判斷。結(jié)果記錄根據(jù)主觀指標(biāo)，即憑工作者目力觀察。作為一般定性觀察，基本上是可靠的。

　　8、熒光顯微鏡使用結(jié)束，關(guān)閉所有電源，做好鏡頭和載物臺的清潔工作，待燈室冷卻至室溫后，用防塵罩蓋好顯微鏡，并做好使用記錄。

熒光顯微鏡使用注意事項

　　1、嚴格按照熒光顯微鏡說明書要求進行操作，不要隨意改變程序。

　　2、熒光顯微鏡應(yīng)在暗室中進行檢查。進入暗室后，接上電源，點燃超高壓汞燈5～15min，待光源發(fā)出強光穩(wěn)定后，眼睛完全適應(yīng)暗室，再開始觀察標(biāo)本。

　　3、防止紫外線對眼睛的損害，在調(diào)整光源時應(yīng)戴上防護眼鏡。

　　4、檢查時間每次以1～2h為宜，超過90min，超高壓汞燈發(fā)光強度逐漸下降，熒光減弱;標(biāo)本受紫外線照射3～5min后，熒光也明顯減弱;所以，Z多不得超過2～3h。

　　5、熒光顯微鏡光源壽命有限，標(biāo)本應(yīng)集中檢查，以節(jié)省時間，保護光源。天熱時，應(yīng)加電扇散熱降溫，新?lián)Q燈泡應(yīng)從開始就記錄使用時間。燈熄滅后欲再用時，須待燈泡充分冷卻后才能點燃。一天中應(yīng)避免數(shù)次點燃光源。

　　6、標(biāo)本染色后立即觀察，因時間久了熒光會逐漸減弱。若將標(biāo)本放在聚乙烯塑料袋中保存，可延緩熒光減弱時間，防止封裱劑蒸發(fā)。

　　7、熒光亮度的判斷標(biāo)準(zhǔn)：一般分為四級，即“-”表示無或可見微弱熒光。“+”表示僅能見明確可見的熒光?！?+”表示可見有明亮的熒光。“+++”表示可見耀眼的熒光。

熒光顯微鏡標(biāo)本制作要求

　　1、載玻片

　　載玻片厚度應(yīng)在0.8～1.2mm之間，太厚的坡片，一方面光吸收多，另一方面不能使激發(fā)光在標(biāo)本上聚集。載玻片必須光潔，厚度均勻，無明顯自發(fā)熒光。有時需用石英玻璃載玻片。

　　2、蓋玻片

　　蓋玻片厚度在0.17mm左右，光潔。為了加強激發(fā)光，也可用干涉蓋玻片，這是一種特制的表面鍍有若干層對不同波長的光起不同干涉作用的物質(zhì)(如氟化鎂)的蓋玻片，它可以使熒光順利通過，而反射激發(fā)光，這種反射的激發(fā)光方可激發(fā)標(biāo)本。

　　3、標(biāo)本

　　組織切片或其他標(biāo)本不能太厚，如太厚激發(fā)光大部分消耗在標(biāo)本下部，而物鏡直接觀察到的上部不充分激發(fā)。另外，細胞重迭或雜質(zhì)掩蓋，影響判斷。

　　4、封裱劑

　　封裱劑常用甘油，必須無自發(fā)熒光，無色透明，熒光的亮度在pH8.5~9.5時較亮，不易很快褪去。所以，常用甘油和0.5mol/lpH9.0～9.5的碳酸鹽緩沖液的等量混合液作封裱劑。

　　5、鏡油

　　一般暗視野熒光顯微鏡和用油鏡觀察標(biāo)本時，必須使用鏡油，Z好使用特制的無熒光鏡油，也可用甘油代替，液體石蠟也可用，只是折光率較低，對圖像質(zhì)量略有影響。