共聚焦顯微鏡與普通顯微鏡相比，采用了能到達Zgao分辨率及重復性的無色差掃描技術(shù)，能產(chǎn)生真正具有三維清晰度的圖像，而且還可以處理活的標本并不對標本造成物理化學特性的破壞。

徠卡 共聚焦顯微鏡平臺 STELLARIS 8

共聚焦顯微鏡的常見問題

　　1、掃描Z終圖像清晰度不高

　　造成此類問題的原因主要有兩個：

　　①物鏡和ZOOM值選用不正確：

　　初學使用者大多喜歡選用共聚焦顯微鏡10x物鏡后，再將ZOOM值調(diào)到所需要的Zda值。通過ZOOM值的增大確實可以將圖像放大，有助于看清圖像的細節(jié)，但是ZOOM的增大是有限定的，這取決于物鏡的倍率。例如在10x物鏡下，ZOOM值超過10就沒有意義了，而且ZOOM值的增大屬于電子放大，放大倍數(shù)越高，清晰度越差。所以在所觀察的樣本形態(tài)體積較小的情況下，多采用高倍物鏡(例如63x水鏡或油鏡)，再適當調(diào)整ZOOM值，ZOOM值Z好不超過2。

　　②誤將Z-Position旋轉(zhuǎn)球的功能和共聚焦顯微鏡焦距微調(diào)旋轉(zhuǎn)器的功能等同：

　　在準確調(diào)焦的基礎(chǔ)上，通過Z-Position旋轉(zhuǎn)球的左右調(diào)節(jié)，可以觀察到目標樣品圖像由Z軸距離變化而引起的圖像清晰度的改變，感覺上和通過調(diào)焦使圖像變清晰一樣。因此很多使用者在沒有調(diào)焦準確的情況下，直接使用-Position旋轉(zhuǎn)球來調(diào)整圖像清晰度而導致成像模糊。

　　2、掃描背景強，圖像質(zhì)量差

　　解決這個問題的關(guān)鍵在于要根據(jù)樣品的制備質(zhì)量選取合適的針孔大小，調(diào)整激光管電壓、光電倍增管功率、信噪比等參數(shù)到Z佳狀態(tài)。這些參數(shù)或設(shè)置有非常密切的關(guān)系，選擇時應(yīng)該綜合考慮。

　　還有一種明場出現(xiàn)環(huán)狀波紋背景的情況是由于操作者在使用共聚焦顯微鏡觀察熒光樣品后，沒有將熒光濾鏡退出并切換到掃描狀態(tài)所致。此時只需要轉(zhuǎn)動調(diào)節(jié)輪至Scan即可。

　　3、串色

　　在使用多種熒光染料標記樣品時或是樣品本身有很強的自發(fā)熒光時，串色的現(xiàn)象就很容易發(fā)生。串色又分為兩種情況：

　?、賰煞N熒光染料的激發(fā)光譜沒有重疊，但是吸收光譜有重疊。這類串色可以通過順序掃描(又稱序列掃描)來完成：即先使用一種熒光染料的激發(fā)光掃描一張圖片，再使用另外一種熒光染料的激發(fā)光掃描第二張圖片。

　?、趦煞N熒光染料的激發(fā)光譜和吸收光譜都有重迭，這種情況只能通過光譜掃描解決。

　　4、多熒光通道掃描圖像的保存及標尺數(shù)值的取整

　　在多通道掃描圖像存盤時，共聚焦顯微鏡系統(tǒng)默認以不同單通道的顏色分別保存。為了便于直觀的觀察各種熒光在不同部位的表達，我們還需要一張各種熒光疊加的合并圖像，此時點擊Overlay鍵即可。在單次掃描圖像完成后，共聚焦顯微鏡系統(tǒng)自動生成的標尺數(shù)值多數(shù)情況下為非整數(shù)，即使在圖像保存前修改為整數(shù)，但一經(jīng)后續(xù)掃描，前幅圖像中修改過的標尺數(shù)值又會恢復到默認的非整數(shù)值。

　　解決這個問題也需要用到Overlay能鍵，即在單次掃描完成并將標尺數(shù)值修改取整后，點擊Overlay鍵顯示合并圖像，再右鍵點擊選中圖片，使之生成Snapshot圖像即可。這兩點是初學使用者很容易忽視的。

　　5、在圖像掃描完成后，各種參數(shù)忘記復位

　　特別是電子放大掃描以后，很多操作者都忘記將共聚焦顯微鏡ZOOM還原，這就造成在下一個樣品掃描時無法在顯示屏上觀察到目標樣本。

共聚焦顯微鏡的維護保養(yǎng)

　　共聚焦顯微鏡是一種集激光技術(shù)、顯微鏡技術(shù)、光度技術(shù)、計算機及圖像處理技術(shù)、精密的機械技術(shù)等多種高技術(shù)于一身的大型儀器。其價格昂貴，在使用過程中要特別注意做好保養(yǎng)和管理工作。通常要做到以下幾點：

　　1、嚴格按照共聚焦顯微鏡操作規(guī)則使用，避免因使用不當造成損壞。

　　2、為保持良好工作狀態(tài)，延長使用壽命，工作環(huán)境應(yīng)保持清潔、干燥、遠離輻射源。共聚焦顯微鏡每次使用后，要做好清潔工作，及時清潔目鏡、物鏡等容易污染的光學部件。

　　3、共聚焦顯微鏡系統(tǒng)應(yīng)設(shè)立專門房間，安裝在防震臺上，工作間內(nèi)要安裝空調(diào)，抽濕及防塵裝置。無論儀器是否工作，Z好使其環(huán)境始終保持在22℃±1℃的恒溫。

　　4、注意保護儀器的光纖，防止被擠壓，儀器常用的零配件及專用工具由專門人員負責保管。

　　5、共聚焦顯微鏡工作間必須常年保持清潔、衛(wèi)生，操作人員必須穿拖鞋、工作服。

　　6、使用者必須培訓合格后，在管理人員的指導下，方可使用共聚焦顯微鏡。