無菌隔離器是為無菌檢查試驗(yàn)提供無菌環(huán)境的一種設(shè)備，它能較好地防止微生物污染待測樣品，可以避免試驗(yàn)用物品和輔助設(shè)備被污染，提高了無菌檢查試驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性，現(xiàn)已在quan球制藥行業(yè)得到廣泛應(yīng)用。

無菌隔離器滅菌的必要性

　　目前無菌隔離器的滅菌通常是采用過氧化氫蒸汽滅菌劑來進(jìn)行。在隔離器內(nèi)部集成有過氧化氫發(fā)生器，可將高濃度的過氧化氫溶液經(jīng)發(fā)生器轉(zhuǎn)化為氣態(tài)，均勻分布在隔離器艙體內(nèi)，在一定濃度及時(shí)間的條件下進(jìn)行滅菌，并在滅菌完成后利用帶gao效過濾器的通風(fēng)系統(tǒng)將艙體內(nèi)殘留的過氧化氫蒸汽排出分解達(dá)到Z終的滅菌效果。

　　無菌隔離器滅菌完成后艙體內(nèi)部環(huán)境的微生物負(fù)載應(yīng)達(dá)到GMP規(guī)定中A級(jí)潔凈度的要求，且滅菌過程不對(duì)物品內(nèi)及試驗(yàn)樣品的微生物有影響。

　　無菌隔離器的系統(tǒng)驗(yàn)證是保證無菌檢查所需無菌環(huán)境的必要條件，而無菌隔離器的滅菌效果驗(yàn)證更是整個(gè)系統(tǒng)驗(yàn)證中尤為重要的驗(yàn)證項(xiàng)目之一。無菌隔離器的滅菌效果評(píng)價(jià)不僅包括滅菌對(duì)物品表面的滅菌效果評(píng)價(jià)，還包括滅菌對(duì)物品及待測樣品內(nèi)部微生物的影響程度評(píng)價(jià)和滅菌殘留物對(duì)物品及待測樣品微生物的影響程度評(píng)價(jià)。

無菌隔離器滅菌方法

　　1、菌懸液的制備

　　①取金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌的新鮮培養(yǎng)物用0.9%無菌氯化鈉溶液制備成每1ml含菌數(shù)小于100cfu的菌懸液15ml;菌懸液平均分裝于3小藍(lán)蓋瓶內(nèi)，瓶口密封(包裝形式與無菌檢查供試品一致)，2～8℃冰箱存放，24h內(nèi)備用。

　　②取白色念珠菌的新鮮培養(yǎng)物用0.9%無菌氯化鈉溶液制備成每1ml含菌數(shù)小于100cfu的菌懸液15ml。菌懸液同金黃色葡萄球菌菌懸液同法分裝及保存。

　?、廴『谇沟男迈r培養(yǎng)物加入3～5ml含0.05%(ml/ml)聚山梨酯80的0.9%無菌氯化鈉溶液，將孢子洗脫。然后取孢子懸液至無菌試管，用含0.05%(ml/ml)聚山梨酯80的0.9%無菌氯化鈉溶液制成每1ml含菌數(shù)小于100cfu的孢子懸液15ml。菌懸液同金黃色葡萄球菌菌懸液同法分裝，2～8℃冰箱存放，2月內(nèi)備用。

　　2、無菌隔離器的準(zhǔn)備

　　以無菌隔離器Zda裝載量的要求將無菌檢查所需物品擺放到無菌隔離器內(nèi)部相對(duì)應(yīng)的位置;無菌隔離手套及艙體密封性測試合格;運(yùn)行參數(shù)已確認(rèn)。

　　3、過氧化氫氣體濃度及分布狀態(tài)確認(rèn)

　　取19支過氧化氫蒸汽化學(xué)指示劑編號(hào)，放入無菌隔離器的手套部位、進(jìn)出風(fēng)口、風(fēng)扇背部、艙體上下四角及垃圾桶底部，滅菌完成后觀察變色情況。

　　4、BI挑戰(zhàn)實(shí)驗(yàn)

　　取13支過氧化氫滅菌生物指示劑(嗜熱脂肪芽孢菌片)分布于無菌隔離器的8個(gè)手套部位、左右艙門、艙體操作臺(tái)面的左右及垃圾桶底部，滅菌完成后菌片取出接種于胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基中，56℃培養(yǎng)，培養(yǎng)7天，觀察培養(yǎng)物的生長情況，同時(shí)取未經(jīng)滅菌的生物指示劑3片同法接種，作為陽性對(duì)照。

　　5、無菌隔離器開啟滅菌

　　開啟無菌隔離器的自動(dòng)運(yùn)行程序，依次按照“自動(dòng)除濕”、“自動(dòng)調(diào)節(jié)”、“自動(dòng)滅菌”、“自動(dòng)通風(fēng)”、“自動(dòng)保壓”五個(gè)階段完成運(yùn)行程序。

　　6、沉降菌檢測

　　取胰酪大豆胨瓊脂平皿培養(yǎng)基15個(gè)，擺放在隔離器艙體操作臺(tái)面上，臺(tái)面兩側(cè)各放置6個(gè)平皿，臺(tái)面左右兩側(cè)各放置1個(gè)平皿，垃圾桶底部放置1個(gè)平皿。平皿暴露采樣4小時(shí)，同時(shí)取3只培養(yǎng)基作空白對(duì)照，采集完的培養(yǎng)基及空白對(duì)照培養(yǎng)基置于20～25℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72小時(shí)后，再轉(zhuǎn)入30～35℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48小時(shí)，記錄培養(yǎng)皿中菌落數(shù)量。

　　7、浮游菌檢測

　　取樣點(diǎn)為隔離器操作平臺(tái)的左右各1個(gè)點(diǎn)，使用胰酪大豆胨瓊脂平皿，在取樣點(diǎn)工作區(qū)附近放置取樣器，進(jìn)行空氣取樣，各取樣點(diǎn)的取樣量為1000升，同時(shí)取3只培養(yǎng)基作空白對(duì)照，采集完的培養(yǎng)基及空白對(duì)照培養(yǎng)基置于20～25℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72小時(shí)后，再轉(zhuǎn)入30～35℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48小時(shí)，記錄培養(yǎng)皿中菌落數(shù)量。

　　8、表面微生物的檢測

　　取胰酪大豆胨瓊脂接觸碟培養(yǎng)基6個(gè)分別對(duì)隔離器艙體內(nèi)表面的上部、下部、左部、右部、前部、后部進(jìn)行接觸10秒采樣;取胰酪大豆胨瓊脂接品平皿培養(yǎng)基(TSA)分別對(duì)8個(gè)手套指模進(jìn)行取樣，同時(shí)取3只培養(yǎng)基作空白對(duì)照，采集完的培養(yǎng)基及空白對(duì)照培養(yǎng)基置于20～25℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72小時(shí)后，再轉(zhuǎn)入30～35℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48小時(shí)，記錄培養(yǎng)皿中菌落數(shù)量。

　　9、選擇性微生物挑戰(zhàn)試驗(yàn)

　　①試驗(yàn)組一：選擇性微生物菌懸液，小瓶密閉分裝后經(jīng)無菌隔離器過氧化氫蒸汽滅菌，接種計(jì)數(shù)。取金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌菌懸液各1ml接種于TSA上，平行接種兩次，30～35℃培養(yǎng)48～72小時(shí)，菌落計(jì)數(shù)，取平均值;取白色念珠菌、黑曲霉菌懸液1ml接種至沙氏葡萄瓊脂培養(yǎng)基上，平行接種兩次，30～35℃培養(yǎng)3～5天，菌落計(jì)數(shù)，取平均值。

　　②試驗(yàn)組二：選擇性微生物菌懸液，小瓶密閉分裝后經(jīng)無菌隔離器過氧化氫蒸汽滅菌，并在滅菌完成后拆開菌懸液瓶口，使內(nèi)容物在無菌隔離器內(nèi)暴露5min，然后同試驗(yàn)組一同法接種計(jì)數(shù)。

　　陽性對(duì)照組：取保存在冰箱內(nèi)同批制造的選擇性微生物菌懸液，同試驗(yàn)組一同法接種數(shù)。

　　陰性對(duì)照組：另取0.9%無菌氯化鈉同法接種于TSA及沙氏葡萄瓊脂培養(yǎng)基上，作為陰性對(duì)照組。

無菌隔離器滅菌結(jié)果分析

　　1、過氧化氫氣體濃度及分布狀態(tài)確認(rèn)結(jié)果

　　如果結(jié)果顯示編號(hào)1～19的過氧化氫蒸汽化學(xué)指示劑均由綠色變?yōu)辄S色，且各指示條變色后顏色基本一致，無肉眼可見的顯著性差異。則表明過氧化氫氣態(tài)濃度在隔離器艙體內(nèi)均勻分布，且達(dá)到滅菌濃度。

　　2、BI挑戰(zhàn)實(shí)驗(yàn)結(jié)果

　　如果結(jié)果顯示編號(hào)1～13的過氧化氫滅菌生物指示劑接種于TSB中培養(yǎng)7天后培養(yǎng)基無渾濁，無菌生長;陽性對(duì)照組培養(yǎng)7天后培養(yǎng)基渾濁，有菌生長。則表明無菌隔離器經(jīng)過滅菌后能殺滅10⁶個(gè)cfu的嗜熱脂肪芽孢桿菌。

　　3、沉降菌檢測結(jié)果

　　如果結(jié)果顯示無菌隔離器內(nèi)部各采樣點(diǎn)的沉降菌菌落數(shù)均為0cfu/皿。則表明滅菌后的無菌隔離器內(nèi)部環(huán)境達(dá)到A級(jí)潔凈度下沉降菌的相關(guān)規(guī)定。

　　4、浮游菌檢測結(jié)果

　　如果隔離器操作平臺(tái)的左右各1個(gè)點(diǎn)的浮游菌Z終菌落數(shù)均為0cfu/皿。則表明滅菌后的無菌隔離器內(nèi)部環(huán)境達(dá)到A級(jí)潔凈度下浮游菌的相關(guān)規(guī)定。

　　5、表面微生物檢測結(jié)果

　　如果表面微生物檢測結(jié)果顯示無菌隔離器內(nèi)部各采樣點(diǎn)的表面微生物菌落數(shù)均為0cfu/皿。則表明滅菌后的無菌隔離器內(nèi)部環(huán)境達(dá)到A級(jí)潔凈度下表面微生物檢測的相關(guān)要求。

　　6、選擇性微生物挑戰(zhàn)試驗(yàn)結(jié)果

　　如果結(jié)果顯示試驗(yàn)組一、試驗(yàn)組二的回收率在90%以上。則表明：①無菌隔離器的滅菌過程未對(duì)物品內(nèi)部微生物造成影響，即過氧化氫蒸汽滅菌不會(huì)殺滅現(xiàn)有包裝形式的物品及供試品內(nèi)部的微生物。②無菌隔離器艙體內(nèi)的過氧化氫殘留對(duì)微生物無影響。