共聚焦顯微鏡也叫激光掃描共聚焦顯微鏡，普遍用于熒光成像和細(xì)胞分析，它成像清晰、放大倍數(shù)大、分辨率高，是生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中強(qiáng)有力的研究工具。

共聚焦顯微鏡原理

　　共聚焦顯微鏡是由顯微鏡光學(xué)系統(tǒng)、激光光源、掃描器及檢測及處理系統(tǒng)4部分組成，采用相干性較好的激光作為光源，在傳統(tǒng)光學(xué)顯微鏡基礎(chǔ)上采用共軛聚焦原理和裝置，并利用計(jì)算機(jī)對圖象進(jìn)行處理的一套觀察、分析和輸出系統(tǒng)。

　　如下圖所示，激光掃描束通過光柵針孔形成點(diǎn)光源，經(jīng)過分光鏡反射至物鏡，聚焦在在標(biāo)本上并進(jìn)行掃描。樣品受到激發(fā)后，發(fā)出的熒光回到分光鏡聚集到探測針孔，Z后經(jīng)過光電倍增管轉(zhuǎn)化為電信號傳輸?shù)接?jì)算機(jī)上顯示為清晰的焦平面圖像。激發(fā)光通過光柵針孔聚焦在樣品上，熒光通過物鏡聚焦在針孔上，此過程中形成兩次聚焦，故被稱為共聚焦顯微鏡。

　　普通生物樣品切片結(jié)構(gòu)復(fù)雜并且有一定厚度，利用普通熒光顯微鏡進(jìn)行觀察時(shí)，樣品發(fā)射的熒光相互疊加，圖像分辨率大大降低。

　　共聚焦顯微鏡的共聚焦成像能有效yi制焦平面外的雜散光和非測量光進(jìn)入探測器，實(shí)現(xiàn)單一焦層面成像，使分辨率大為提高。載物臺(tái)沿橫向均勻移動(dòng)時(shí)，可形成清晰的單層圖像，沿縱向移動(dòng)，可實(shí)現(xiàn)樣品不同深度的逐層掃描，經(jīng)過三維重建得到樣品的三維立體結(jié)構(gòu)，即所謂的“光學(xué)CT”。使用熒光探針對樣品進(jìn)行標(biāo)記后再運(yùn)用共聚焦顯微鏡觀測，不僅可觀察固定的各種細(xì)胞和組織結(jié)構(gòu)，還可對活細(xì)胞的形態(tài)、結(jié)構(gòu)、離子等進(jìn)行定性定量定時(shí)觀察及測定。

共聚焦顯微鏡的發(fā)展歷史

　　1665年，diyi臺(tái)光學(xué)顯微鏡的問世，為人類打開了微觀世界的大門，成為研究生物器官、組織和細(xì)胞的重要工具，極大地推動(dòng)了生命科學(xué)相關(guān)領(lǐng)域的發(fā)展。隨著現(xiàn)代科學(xué)技術(shù)的飛速發(fā)展，以及yi療、生命科學(xué)、材料科學(xué)以及相關(guān)工業(yè)領(lǐng)域等的廣泛應(yīng)用需求，人們對微觀事物的認(rèn)知要求已不僅局限于二維圖像觀測，同時(shí)需要對微小物體的三維結(jié)構(gòu)進(jìn)行了解和研究。普通顯微鏡原理為物面前后一定厚度內(nèi)飛所有斷層圖像的疊加，已無法達(dá)到應(yīng)用需求。

　　1951年，提出了飛點(diǎn)掃描顯微鏡的概念，打破傳統(tǒng)光學(xué)顯微鏡將整幅圖像同時(shí)成在系統(tǒng)像面上的方法，轉(zhuǎn)而通過掃描激光光點(diǎn)與樣品之間的相對運(yùn)動(dòng)，建立物點(diǎn)與像面點(diǎn)間的對應(yīng)關(guān)系。1957年，首次闡述了掃描共聚焦顯微鏡技術(shù)的基本原理。

　　1985年，共聚焦顯微鏡隨著光學(xué)、視頻和計(jì)算機(jī)等技術(shù)飛速發(fā)展而誕生。與以往的普通熒光顯微鏡相比，共聚焦顯微鏡具有高分辨率、高靈敏度、可三維重建和動(dòng)態(tài)分析等優(yōu)點(diǎn)，使拍攝的圖像更為清晰精確和數(shù)字化，這些特征使它可以同時(shí)用于研究和分析靜態(tài)及動(dòng)態(tài)變化過程中的細(xì)胞結(jié)構(gòu)。

　　20世紀(jì)90年代，共聚焦顯微鏡才開始商品化，但是隨著技術(shù)的不斷發(fā)展和完善，該儀器的性能也得到快速的改進(jìn)和提升。共聚焦顯微鏡廣泛應(yīng)用于組織學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)、生理學(xué)和病理學(xué)等研究領(lǐng)域中。

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共聚焦顯微鏡發(fā)展趨勢

　　共聚焦顯微鏡在技術(shù)層面上為了獲得更好的觀察效果，著力于從提高分辨率、降低光毒性、提高掃描速度、厚樣品觀察、活體觀察等方面提升技術(shù)水平。目前來看Z有效，對共聚焦顯微鏡技術(shù)推動(dòng)Zda的是超高分辨率顯微術(shù)，突破光學(xué)極限使研究者能夠獲得更精細(xì)的細(xì)胞結(jié)構(gòu)，有利于研究者更深刻的認(rèn)識(shí)生命活動(dòng)。共聚焦顯微鏡技術(shù)下一步的研究zhong點(diǎn)應(yīng)該集中在以下幾點(diǎn)：

　　1、更快的掃描速度

　　目前共聚焦掃描速度受限于掃描設(shè)備的機(jī)械結(jié)構(gòu)，要想獲得更快的掃描速度只能犧牲分辨率。而很多生物過程非常迅速，目前仍然無法檢測。

　　2、更wan美的超高分辨率技術(shù)

　　目前超高分辨率技術(shù)有STORM、PALM、STED和SSIM幾種技術(shù)，分辨率從20～200nm不等，但是各種技術(shù)均有一定缺陷，例如在樣品處理、Z軸方向、光毒性等方面還不近wan美，在實(shí)際觀察中往往很難達(dá)到極限分辨率。

　　3、更強(qiáng)的兼容性

　　共聚焦顯微鏡技術(shù)涉及到多種激發(fā)方式，例如上文提到的多光子和光片式觀察，相干反斯托克斯拉曼散射在理論上可以公用一套激光系統(tǒng)。超高分辨率顯微術(shù)可以搭配白激光技術(shù)。但目前由于各公司的zhuan利問題，在成套性和兼容性上尚有改進(jìn)余地，目前的設(shè)備并無法充分發(fā)揮應(yīng)用的技術(shù)優(yōu)勢。