掃描電鏡(SEM)是介于透射電鏡和光學(xué)顯微鏡之間的一種微觀形貌觀察手段，可直接利用樣品表面材料的物質(zhì)性能進行微觀成像。掃描電鏡的基本部件有透鏡系統(tǒng)、電子槍、電子收集器、觀察和記錄影像的陰極射線管等。

一、樣品的初步處理

　　1、取材

　　對掃描電鏡來說，樣品可以稍大些，面積可達8mm×8mm，厚度可達5mm。對于易卷曲的樣品如血管、胃腸道粘膜等，可固定在濾紙或卡片紙上，以充分暴露待觀察的組織表面。

　　2、樣品的清洗

　　用掃描電鏡觀察的部位常常是樣品的表面，即組織的游離面。由于樣品取自活體組織，其表面常有血液、組織液或粘液附著，這會遮蓋樣品的表面結(jié)構(gòu)，影響觀察。因此，在樣品固定之前，要將這些附著物清洗干凈。清洗的方法有以下幾種：

　?、儆玫葷B的生理鹽水或緩沖液清洗;

　?、谟?%的蘇打水清洗;

　　③用超聲震蕩或酶消化的方法進行處理。

納克微束高分辨場發(fā)射掃描電鏡 FE-1050系列

　　3、固定

　　固定所用的試劑和透射電鏡樣品制備相同，常用戊二醛及鋨酸雙固定。由于樣品體積較大，固定時間應(yīng)適當(dāng)延長。也可用快速冷凍固定。

　　4、脫水

　　樣品經(jīng)漂洗后用逐級濃度的酒精或丙酮脫水，然后進入中間液，一般用醋酸異戊酯作中間液。掃描電鏡生物樣品制備技術(shù)大多數(shù)生物樣品都含有水分，而且比較柔軟，因此，在進行掃描電鏡觀察前，要對樣品作相應(yīng)的處理。掃描電鏡樣品制備的主要要求是：盡可能使樣品的表面結(jié)構(gòu)保存好，沒有變形和污染，樣品干燥并且有良好導(dǎo)電性能。

二、樣品的干燥

　　掃描電鏡觀察樣品要求在高真空中進行。無論是水或脫水溶液，在高真空中都會產(chǎn)生劇烈地汽化，不僅影響真空度、污染樣品，還會破壞樣品的微細結(jié)構(gòu)。因此，樣品在用電鏡觀察之前必須進行干燥。干燥的方法有以下幾種：

　　1、空氣干燥法

　　空氣干燥法又稱自然干燥法，就是將經(jīng)過脫水的樣品，讓其暴露在空氣中使脫水劑逐漸揮發(fā)干燥。這種方法的Zda優(yōu)點是簡便易行和節(jié)省時間;它的主要缺點是在干燥過程中，組織會由于脫水劑揮發(fā)時表面張力的作用而產(chǎn)生收縮變形。因此，該方法一般只適用于表面較為堅硬的樣品。

　　2、臨界點干燥法

　　臨界點干燥法是利用物質(zhì)在臨界狀態(tài)時，其表面張力等于零的特性，使樣品的液體完全汽化，并以氣體方式排掉，來達到完全干燥的目的。這樣就可以避免表面張力的影響，較好地保存樣品的微細結(jié)構(gòu)。此法操作較為方便，所用的時間也不算長，一般約2～3小時即可完成，所以是Z為常用的干燥方法。但用此法，需要特殊儀器設(shè)備。臨界點干燥是在臨界點干燥儀中進行的，操作步驟如下：

　?、俟潭ā⒚撍喊闯Ｒ?guī)方法進行。如掃描電鏡樣品是用乙醇脫水的，在脫水至1**%后，要用純丙酮置換15～20分鐘。

　?、谵D(zhuǎn)入中間液：由純丙酮轉(zhuǎn)入中間液醋酸異戊酯中，時間約15～30分鐘。

　　③移至樣品室：將樣品從醋酸異戊酯中取出，放入樣品盒，然后移至臨界點干燥儀的樣品室內(nèi)，蓋上蓋并擰緊以防漏氣。

　?、苡靡后w二氧化碳置換醋酸異戊酯：在達到臨界狀態(tài)(31℃、72.8大氣壓)后，將溫度再升高10℃，使液體二氧化碳氣化，然后打開放氣閥門，逐漸排出氣體，掃描電鏡樣品即完全干燥。

　　3、冷凍干燥法

　　冷凍干燥法是將經(jīng)過冷凍的樣品置于高真空中，通過升華除去樣品中的水分或脫水劑的過程。冷凍干燥的基礎(chǔ)是冰從樣品中升華，即水分從固態(tài)直接轉(zhuǎn)化為氣態(tài)，不經(jīng)過中間的液態(tài)，不存在氣相和液相之間的表面張力對樣品的作用，從而減輕在干燥過程中對樣品的損傷。冷凍干燥法有兩種，即含水樣品直接冷凍干燥和樣品脫水后冷凍干燥。

　　①含水樣品直接冷凍干燥法

　　取材固定：按常規(guī)方法進行。

　　置于冷凍保護劑中：將掃描電鏡樣品置于冷凍保護劑中浸泡數(shù)小時。常用的冷凍保護劑為10%～20%二甲基亞砜水溶液，或15%～40%甘油水溶液。

　　驟冷：將經(jīng)過保護劑處理的樣品迅速投入用液氮預(yù)冷至(150℃的氟利昂冷凍劑中，使樣品中的水分很快凍結(jié)。

　　干燥：將已凍結(jié)的掃描電鏡樣品移到冷凍干燥器內(nèi)已預(yù)冷的樣品臺上，抽真空，經(jīng)幾小時或數(shù)天后，樣品即達到干燥。本方法不需要脫水，避免了有機溶劑對樣品成分的抽提作用，不會使樣品收縮，也是較早使用的方法。但是，由于花費時間長，消耗液氮多，容易產(chǎn)生冰晶損傷，因此未被廣泛應(yīng)用。

　　②樣品脫水后冷凍干燥

　　掃描電鏡樣品用乙醇或丙酮脫水后過渡到某些易揮發(fā)的有機溶劑中，然后連同這些溶劑一起冷凍并在真空中升華而達到干燥。和前一種方法比較，本方法的優(yōu)點是不會產(chǎn)生冰晶損傷，且干燥時間短。不足之處是有機溶劑對樣品成分有抽提作用，造成部分內(nèi)含物丟失。乙腈真空干燥法：這是一種利用乙腈在急速蒸發(fā)時會冷卻固化的性質(zhì)將樣品干燥的方法。其操作步驟如下：

　　固定、水洗：按常規(guī)方法進行。

　　乙腈置換：使用50%-70%-80%-90%的乙腈水溶液置換，Z后用1**%乙腈代替，每步驟15～20分鐘。

　　干燥：至純乙腈時，放入真空鍍膜臺抽真空，乙腈和樣品在真空中很快致冷而被凍結(jié)(凍結(jié)的溫度為(45℃)，變成冰狀固體。然后繼續(xù)抽真空，使凍結(jié)的乙腈升華，約需30分鐘，樣品即達干燥。

　　掃描電鏡樣品干燥后要粘在樣品臺上。對于不鍍膜而直接觀察的樣品，必須用導(dǎo)電膠來粘固;對于要鍍膜的樣品，則可以用膠水或wan能膠來代替，微細的樣品如粉末、纖維等也可用雙面膠紙來粘貼。

三、樣品的導(dǎo)電處理

　　生物樣品經(jīng)過脫水、干燥處理后，其表面不帶電，導(dǎo)電性能也差。用掃描電鏡觀察時，當(dāng)入射電子束打到樣品上，會在樣品表面產(chǎn)生電荷的積累，形成充電和放電效應(yīng)，影響對圖象的觀察和拍照記錄。因此在觀察之前要進行導(dǎo)電處理，使樣品表面導(dǎo)電。常用的導(dǎo)電方法有以下幾種：

　　1、金屬鍍膜法

　　金屬鍍膜法是采用特殊裝置將電阻率小的金屬，如金、鉑、鈀等蒸發(fā)后覆蓋在樣品表面的方法。掃描電鏡樣品鍍以金屬膜后，不僅可以防止充電、放電效應(yīng)，還可以減少電子束對樣品的損傷作用，增加二次電子的產(chǎn)生率，獲得良好的圖象。

　　①真空鍍膜法

　　真空鍍膜法是利用真空膜儀進行的。其原理是在高真空狀態(tài)下把所要噴鍍的金屬加熱，當(dāng)加熱到熔點以上時，會蒸發(fā)成極細小的顆粒噴射到樣品上，在樣品表面形成一層金屬膜，使樣品導(dǎo)電。噴鍍用的金屬材料應(yīng)選擇熔點低、化學(xué)性能穩(wěn)定、在高溫下和鎢不起作用以及有高的二次電子產(chǎn)生率、膜本身沒有結(jié)構(gòu)?，F(xiàn)在一般選用金或金和碳。為了獲得細的顆粒，有用鉑或用金-鈀、鉑-鈀合金的。金屬膜的厚度一般為10nm～20nm。真空鍍膜法所形成的膜，金屬顆粒較粗，膜不夠均勻，操作較復(fù)雜并且費時，目前已經(jīng)較少使用。

　　②離子濺射鍍膜法

　　在低真空(0.1～0.01托)狀態(tài)下，在陽極與陰極兩個電極之間加上幾百至上千伏的直流電壓時，電極之間會產(chǎn)生輝光放電。在放電的過程中，氣體分子被電離成帶正電的陽離子和帶負電的電子，并在電場的作用下，陽離子被加速跑向陰極，而電子被加速跑向陽極。如果陰極用金屬作為電極(常稱靶極)，那么在陽離子沖擊其表面時，就會將其表面的金屬粒子打出，這種現(xiàn)象稱為濺射。此時被濺射的金屬粒子是中性，即不受電場的作用，而靠重力作用下落。如果將樣品置于下面，被濺射的金屬粒子就會落到掃描電鏡樣品表面，形成一層金屬膜，用這種方法給樣品表面鍍膜，稱為離子濺射鍍膜法。

　　2、組織導(dǎo)電法

　　用金屬鍍膜法使掃描電鏡樣品表面導(dǎo)電，需要特殊的設(shè)備，操作比較復(fù)雜，同時對樣品有一定程度的損傷。為了克服這些不足，有人采用組織導(dǎo)電法(又稱導(dǎo)電染色法)，即利用某些金屬溶液對生物樣品中的蛋白質(zhì)?脂類和醣類等成分的結(jié)合作用，使樣品表面離子化或產(chǎn)生導(dǎo)電性能好的金屬鹽類化合物，從而提高樣品耐受電子束轟擊的能力和導(dǎo)電率。

　　此法的基本處理過程是將經(jīng)過固定、清洗的樣品，用特殊的試劑處理后即可觀察。由于不經(jīng)過金屬鍍膜，所以不僅能節(jié)省時間，而且可以提高分辨率，還具有堅韌組織，加強固定效果的作用。

　　組織導(dǎo)電法主要有碘化鉀導(dǎo)電染色法、碘化鉀-醋酸鉛導(dǎo)電法、丹寧酸-鋨酸導(dǎo)電法等。比較常用的是丹寧酸-鋨酸導(dǎo)電法，其具體操作方法如下：

　?、贅悠诽幚恚喊闯Ｒ?guī)方法取材、清洗及用戊二醛固定。

　?、趯?dǎo)電染色：將樣品放入2%～4%丹寧酸溶液中浸泡。如果觀察表面結(jié)構(gòu)，浸泡時間為30分鐘;如果觀察內(nèi)部結(jié)構(gòu)，浸泡時間為8小時，即可過夜。在浸泡過程中，可更換一次溶液。

　　③清洗及再固定：用磷酸緩沖液充分清洗，然后放入1%鋨酸中固定2～4小時，再用磷酸緩沖液清洗。

　?、苊撍透稍铮喊闯Ｒ?guī)方法。

　　⑤掃描電鏡觀察。

四、細胞內(nèi)部結(jié)構(gòu)冷凍割斷法

　　該方法簡便，結(jié)構(gòu)清晰，已得到廣泛應(yīng)用。其操作方法如下：

　　1、取材和固定：為了使細胞結(jié)構(gòu)清晰，不被過多的血細胞污染，可在取材前用灌注法沖洗。即先將動物麻醉，經(jīng)腹主動脈注入生理鹽水或低分子量的右,切開下腔靜脈放血，至無血色為止。然后迅速取材，將樣品修成1mm×1mm×5mm大小，投入1%鋨酸溶液中固定1小時，用1/15M磷酸緩沖液(pH7.4)清洗兩次，每次10分鐘。

　　2、二甲基亞砜浸泡：將樣品依次放入25%、50%二甲基亞砜溶液中，各浸泡30分鐘。

　　3、割斷：用冷凍割斷裝置進行割斷。然后將割斷后的樣品放到50%二甲基亞砜中，等融化后再用1/15M磷酸緩沖液浸洗，每次10分鐘，換液5次。

　　4、軟化及后固定：將樣品放入0.1%鋨酸中軟化，溫度20℃，時間48～72小時。然后用1%鋨酸固定1小時，雙蒸水浸洗1小時，換液幾次，需徹底清洗干凈。

　　5、導(dǎo)電染色：將樣品放入2%丹寧酸中2小時(或過夜)，以雙蒸水清洗1小時，換液幾次。雙蒸水清洗1小時。

　　6、脫水、干燥及鍍膜：按常規(guī)方法進行。

五、鑄型技術(shù)

　　為了研究空腔臟器特別是血管系統(tǒng)復(fù)雜的立體分布，先向腔內(nèi)注射某種成形物質(zhì)，待該物硬化后再把組織腐蝕去掉，剩下的成形物即能顯示血管系統(tǒng)的立體分布，這種技術(shù)稱鑄型技術(shù)。如果是研究血管系統(tǒng)，稱為血管鑄型。用鑄型技術(shù)制作的標(biāo)本，經(jīng)過鍍膜后，就可進行掃描電鏡觀察。

　　常用的鑄型劑有甲基丙烯酸酯、聚苯乙烯及其共聚物以及ABS等。ABS是一種樹脂，為丙烯晴、丁二烯和苯乙烯的三元共聚物，被認為是比較理想的鑄型劑。下面簡單介紹用ABS制作血管鑄型標(biāo)本的方法：

　　1、灌流和注入鑄型劑

　　首先將準(zhǔn)備灌注的器官取下或保持自然位置，找到動脈，插入玻璃管或靜脈穿刺針，并以粗絲線結(jié)扎之，用普通流水或溫鹽水將血管中的血液沖洗干凈。然后灌注鑄型劑ABS丁酮溶液，濃度為5%～30%，注入的壓力為100mmHg。注入鑄型劑的臟器，可以放在50℃～60℃的溫水中浸泡6小時左右，這樣既能保持臟器的原形，也有助于鑄型劑的硬化。

　　2、腐蝕和清洗

　　將標(biāo)本放入10%～20%氫氧化鈉或氫氧化鉀溶液中腐蝕，也有放20%～30%鹽酸中腐蝕。時間一般為5～7天。若用稀鹽酸腐蝕，可加入5%～10%胃蛋白酶，腐蝕的效果更好。然后用流水將血管鑄型周圍被腐蝕的組織沖洗干凈，時間為24～72小時，沖洗的速度要慢。

　　3、顯微解剖和剝制鑄型

　　為了暴露和切取要觀察的部分，需要在解剖顯微鏡下進行。如果鑄型太硬，可將鑄型浸入酒精中，加溫至40～60℃，能使鑄型變軟，便于解剖和切取。

　　4、干燥和鍍膜

　　將切取的鑄型用蒸餾水洗干凈，用濾紙吸干后放37℃溫箱中30～60分鐘，Z后放干燥缸中保存。鍍膜可用真空噴鍍，也可用離子鍍膜，方法同前。鍍膜后就可用掃描電鏡觀察。