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儀器網(wǎng)> 資料庫(kù)>大鼠肝細(xì)胞的分離

大鼠肝細(xì)胞的分離

本文由 上海滬宇生物科技有限公司 整理匯編

2018-10-08 10:01 670閱讀次數(shù)

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實(shí)驗(yàn)試劑鈉60mg/kg鏈蛋白酶E灌注液含Ⅳ型膠原酶的灌注液Histodenz液RPMI1640液胎牛血清碘酒乙醇實(shí)驗(yàn)設(shè)備高速離心機(jī)平皿硅化三角燒瓶“0”號(hào)絲線針管一次性輸液管恒溫振蕩器120目、300目鋼網(wǎng)50ml聚丙烯離心管實(shí)驗(yàn)材料實(shí)驗(yàn)室大鼠實(shí)驗(yàn)步驟1.大鼠以3%鈉60mg/kg麻醉后,依次碘酒、乙醇消毒;2.以十字型切口打開腹腔,暴露內(nèi)臟,將腸管推向腹腔的左側(cè),暴露出下腔靜脈和門靜脈,首先游離出下腔靜脈,將膽總管結(jié)扎。然后分離門靜脈,將其分支一一結(jié)扎,并在門靜脈的近端和遠(yuǎn)端分別預(yù)置“0”號(hào)絲線一根,用針管內(nèi)預(yù)先吸有肝素的l8號(hào)套管針穿刺門靜脈,退出針芯,見門靜脈有回血后結(jié)扎固定,迅速接通灌注系統(tǒng),并剪開下腔靜脈建立流出道,以20ml/min的速率灌注預(yù)灌注液(37℃),同時(shí)將肝臟完整地分離下來,置入一平皿中;3.灌注約10min后,肝臟完全變?yōu)榈S褐色,關(guān)閉預(yù)灌注液三通開關(guān),以15ml/min速率灌注50ml(25mg)鏈蛋白酶E灌注液,然后再以15ml/min速率灌注含Ⅳ型膠原酶的灌注液(37℃);4.將一根一次性輸液管一端浸入培養(yǎng)皿液面以下,另一端插入膠原酶溶液瓶,建立膠原酶的循環(huán)灌注;5.20~25min后,當(dāng)肝臟組織完全變軟,撕去肝包膜,去除結(jié)締組織,鈍性粉碎肝組織制備細(xì)胞懸液;6.將細(xì)胞懸液倒入一預(yù)先裝有100ml、37℃預(yù)熱的振蕩消化液硅化三角燒瓶中,將三角燒瓶放恒溫振蕩器中振蕩消化30min(200r/min,37℃),振蕩消化后的細(xì)胞懸液依次經(jīng)120目、300目鋼網(wǎng)過濾,收集于2個(gè)50ml聚丙烯離心管中;7.1700r/min離心5min(4℃),吸棄上清液。每管加入40mlRPMI1640液,反復(fù)吹打,使細(xì)胞充分懸??;8.200r/min離心2min(20℃)2次,使細(xì)胞懸液中剩余的肝細(xì)胞沉淀,去除肝細(xì)胞;9.上清液l700r/min離心5min(4℃),沉淀肝的非實(shí)質(zhì)細(xì)胞,吸棄上清液,用RPMI1640液1700r/min離心5min(4℃)再?zèng)_洗2~3次;10.將33%的Histodenz液以RPMI1640液稀釋成為11%Histodenz液,加入l1%Histodenz液重懸細(xì)胞沉淀,反復(fù)輕柔吹打,使細(xì)胞充分懸?。?1.配制15%的Histodenz液,在10ml離心管的底部先小心地鋪4ml15%的Histodenz,然后將l1%Histodenz細(xì)胞懸液小心地鋪在15%的Histodenz液上,上面再小心地滴加一層無血清的RPMI1640細(xì)胞培養(yǎng)液。在這一過程中一定要避免各層液體混合;12.兩離心管3000r/min離心30min(4℃),垂直位小心取下離心管,可以看到明顯的細(xì)胞分層,將11%Histodenz液與15%Histodenz液交界面間的細(xì)胞仔細(xì)地吸出,用無血清RPMI1640液1700r/min離心5min(4℃)沖洗2次;13.培養(yǎng):用含體積分?jǐn)?shù)20%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液將細(xì)胞懸浮,移人培養(yǎng)瓶,于37℃、CO2體積分?jǐn)?shù)為5%的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)30min,計(jì)數(shù),以1×106個(gè)/ml的濃度接種于新瓶中培養(yǎng),24h后洗去未貼壁的細(xì)胞,即可獲得純化的大鼠肝細(xì)胞。

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