本文由 歐羅拉生物科技有限公司 整理匯編

2024-09-29 01:09 354閱讀次數(shù)

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  腐殖酸的污染。土壤中，特別是森林，草地土壤含有非常豐富的腐殖酸。腐殖酸是一系列的有機(jī)物分子，部分分腐殖酸同核酸分子非常類似，在純化過程中非常難于去除。微量的腐殖酸污染都會(huì)導(dǎo)致下游應(yīng)用，如PCR，酶切的失敗。裂解方法。土壤樣品中含有各種微生物，如細(xì)菌和真菌等。革蘭氏陽性細(xì)菌和真菌都含有非常厚的細(xì)菌壁，讓這些微生物的細(xì)胞壁有效破裂是提取高產(chǎn)量宏基因組DNA的關(guān)鍵。由于土壤樣品的復(fù)雜性，使用酶法（如溶菌酶，破壁酶，蝸牛酶）或液氮研磨都不可行，因?yàn)橥寥乐泻懈鞣N金屬離子或YZ因子導(dǎo)致消化酶的活性失活，或土壤中的沙粒等會(huì)導(dǎo)致液氮研磨很難進(jìn)行。土壤DNA提取的解決簡(jiǎn)介土壤樣品含有大量的微生物，其中絕大部分的微生物都是無法直接培養(yǎng)進(jìn)行繁殖和研究。從土壤樣品中提取DNA是研究土壤微生物Z為有效的方法。目前從土壤樣品中提取微生物DNA的方法主要有直接法和間接法。直接法是指把土壤樣品放在裂解液中，經(jīng)過有效的破壁方法使微生物的DNA全部釋放到裂解液中，然后再進(jìn)行分離提取，如Zhou的方法。間接法是指將土壤放在一種的緩沖液中，如BufferPBS等，把微生物從土壤中分離出來，然后再進(jìn)行DNA的提取。間接法可大大降低土壤中腐殖酸，重金屬鹽對(duì)DNA提取帶來的影響，但是這種方法會(huì)丟失許多微生物，得到的DNA并非土壤樣品中的全基因組（宏基因組），目前已經(jīng)很少研究者會(huì)采用這種方法。從土壤樣品中直接提取DNA可Zda可能性地獲得全基因組，但是這種方法卻面臨以下幾個(gè)問題：1.2.3.DNA得率難于控制。土壤樣品或因肥沃，或因貧瘠，或因含水量豐富，或因干枯，或因取樣的深淺度，都會(huì)造成微生物數(shù)量和品種發(fā)生劇烈改變。在一個(gè)小范圍的土壤樣品DNA含量往往會(huì)差別成千上百倍。此外，某些土壤中含有的化學(xué)成分，如重金屬鹽，粘土物質(zhì)都會(huì)造成DNA得率降低。OmegaBiotek公司的E.Z.N.A.SoilDNAKit是目前土壤DNA提取Z為優(yōu)化的試劑盒。該試劑盒采用玻璃珠研磨法和熱激化學(xué)破壁法，可不需特殊的珠磨儀，在點(diǎn)動(dòng)渦旋儀就可進(jìn)行，適合于廣大的研究室。試劑盒中HTRReagent是OmegaBiotek公司du家開發(fā)的腐殖酸吸附劑，能GX去除各種腐殖酸的污染。此外還采用無醇的硅膠柱純化方式，可GX去除土壤中各種可溶性金屬鹽，以及其它可溶性的YZ因子。該試劑盒已經(jīng)成功地提取如下土壤（部分是客戶反饋）：自然保護(hù)區(qū)森林的土壤（長(zhǎng)達(dá)30-40年森林土壤，表層有30-50cm落葉層），紅樹林土壤，草地，耕地，海底泥，污泥，礦石區(qū)泥土，有機(jī)物污染的泥土，池塘泥，垃圾泥，空調(diào)管道堆積物等。實(shí)驗(yàn)方法為表明該試劑盒的優(yōu)勢(shì)性，我們選擇以下不同組織樣品進(jìn)行DNA提取實(shí)驗(yàn)，每個(gè)樣品重復(fù)3次。l森林類樣品：自然保護(hù)區(qū)森林土壤（廣東黑石頂自然保護(hù)區(qū)）和海南島紅樹林保護(hù)區(qū)l礦石區(qū)樣品：礦石區(qū)水底土壤（濕）和礦石區(qū)地表土壤（干）l耕地樣品：稻田土壤，菜地土壤l有機(jī)物污染地表樣品：污水溝衍泥和生活垃圾堆放區(qū)操作方法（按SoilDNAKit試劑盒進(jìn)行）簡(jiǎn)單描述以下：1.取▲0.5g森林土壤/耕地土壤，或◆4g礦石區(qū)土壤和有機(jī)物污染土壤至15ml離心管中；2.加入▲0.5g酸洗玻璃珠，或◆4g酸洗玻璃珠；3.加入▲1mlBufferSXLMLus，或◆8mlBufferSXLMLus；4.立即在渦旋儀上Z高速渦旋3分鐘。5.加入▲100ul，或◆800ulBufferDS，渦旋15s混勻6.轉(zhuǎn)移至預(yù)熱至70oC水浴鍋中，水浴10-15分鐘。7.3000xg離心3分鐘，轉(zhuǎn)移▲800ul，或◆7ml上清，并加入▲270ulBufferSP2或◆2.3mlBufferSP2，渦旋混勻；8.▲10,000xg離心5分鐘，或◆5，000xg離心10分鐘；9.把上清液轉(zhuǎn)稱至新的2ml/15ml離心管中，加入0.7倍的異丙醇。（在處理礦石區(qū)樣品時(shí)和有機(jī)物污染的樣品中，還加入133ul糖原溶液），渦旋混勻；10.▲10,000xg離心5分鐘，或◆5，000xg離心10分鐘沉淀收集DNA。11.倒棄上清液，并反扣于吸水紙上5分鐘；12.加入200ulElutionBuffer，渦旋5秒。65℃水浴20-60分鐘，讓DNA充分溶液。13.加入50ulHTR,反應(yīng)2min后，離心，取上清。14.上清加入等體積（約200ul）XP2Buffer，均勻后上柱。15.加入300ulXP2Buffer，洗滌一次。16.加入700ulSPWWashBuffer，洗滌兩次。17.空甩后，加入適當(dāng)量的ElutionBuffer洗脫即可。實(shí)驗(yàn)結(jié)果1.DNA電泳結(jié)果取10ul純化的基因組DNA上樣于0.8%瓊脂糖凝膠，80V電泳30分鐘，結(jié)果如下。0.5g森林類土壤樣品（前兩個(gè)自然保護(hù)區(qū)森林土壤，后兩個(gè)為紅樹林土壤）0.5g耕地類土壤樣品A:水稻田土壤B:玉米土壤4g有機(jī)物污染土壤樣品A:生活垃圾堆放地B:污水溝底泥4g礦石泥1和3是兩個(gè)礦石區(qū)水底土壤（濕）2和4礦石區(qū)地表土壤（干）相關(guān)附錄【omega】基因組DNA抽提試劑盒系列　Se全血DNA小量提取試劑盒：從小于1ml血液樣品中純化2-30ug淋巴細(xì)胞基因組DNAD3471-00SEBloodDNAKit（20）150D3471-01SEBloodDNAKit（50）300D3471-02SEBloodDNAKit（200）1000全血DNA小量提取試劑盒：從小于250ul血液樣品中純化2-30ugDNA，包括寄生的病毒等基因組DNAD3392-00BloodDNAKit（5）108D3392-01BloodDNAKit（50）720D3392-02BloodDNAKit（200）2610全血DNA中/大量提取試劑盒：從小于10ml、20ml血液樣品中純化200-250ug或400-600ug基因組DNAD3494-01BloodDNAMidiKit（10）495D3494-03BloodDNAMidiKit（50）2250D3494-04BloodDNAMidiKit（100）4320D2492-01BloodDNAMaxiKit（5）450D2492-02BloodDNAMaxiKit（20）1710D2492-03BloodDNAMaxiKit（50）3600[詳細(xì)]

  2024-09-29 06:33

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  2016-04-25 00:00

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• 反應(yīng)釜和攪拌器的wan美搭配

  反應(yīng)釜和攪拌器的wan美搭配[詳細(xì)]

  2016-06-02 00:00

  產(chǎn)品樣冊(cè)

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• 基因組DNA提取相關(guān)

  基因組DNA相關(guān)基因組DNA提取試劑盒簡(jiǎn)介：DNA是遺傳信息的載體，是Z重要的生物信息分子，是分子生物學(xué)研究的主要對(duì)象，為了進(jìn)行測(cè)序、雜交、基因表達(dá)、文庫構(gòu)建等試驗(yàn)，獲得高分子量和高純度的基因組DNA是非常重要的前提，因此基因組DNA的提取也是分子生物學(xué)試驗(yàn)技術(shù)中Z重要、Z基本的操作之一。Solarbio公司提供各種不同樣品基因組DNA提取試劑盒，如植物、動(dòng)物、細(xì)菌、細(xì)胞、血液、酵母等基因組DNA提取試劑盒。所提取的基因組純度高，片段大小在50kb左右。用戶可根據(jù)需要選用不同的試劑盒來進(jìn)行不同樣品的抽提?；蚪MDNA提取的原則：1、保證核酸一級(jí)結(jié)構(gòu)的完整性（因?yàn)檫z傳信息全部?jī)?chǔ)存在核酸一級(jí)結(jié)構(gòu)中，故完整的一級(jí)結(jié)構(gòu)是保證核酸結(jié)構(gòu)與功能研究的基礎(chǔ)）。2、排除其它分子（如蛋白質(zhì)、多糖、脂類、有機(jī)溶劑等）的污染，使下游試驗(yàn)順利進(jìn)行?；蚪MDNA提取的原理和方法：DNA與組蛋白構(gòu)成核小體，核小體纏繞成中空的螺旋管狀結(jié)構(gòu)，即染色絲，染色絲再與許多非組蛋白形成染色體。染色體存在于細(xì)胞核中，外有核膜及胞膜。從組織中提取DNA必須先將組織分散成單個(gè)細(xì)胞，然后破碎胞膜及核膜，使染色體釋放出來，同時(shí)去除與DNA結(jié)合的組蛋白及非組蛋白。1、樣品預(yù)處理從各種不同來源的樣品（如細(xì)菌、酵母、血液、動(dòng)植物組織細(xì)胞等）中提取高純度的基因組DNA，因細(xì)胞結(jié)構(gòu)及其成分不同，樣品預(yù)處理方式也不同，以下簡(jiǎn)單介紹常用提取材料的預(yù)處理方式，若需詳細(xì)了解，請(qǐng)參考本公司各基因組DNA提取試劑盒說明書。部分樣品預(yù)處理方式:植物材料液氮研磨動(dòng)物材料勻漿、液氮研磨培養(yǎng)細(xì)胞蛋白酶K處理細(xì)菌溶菌酶破壁酵母破壁酶破壁、玻璃珠研磨血液紅細(xì)胞裂解液去紅細(xì)胞2、細(xì)胞裂解CTAB法：適用于植物組織、真菌等。CTAB是一種陽離子去污劑，可溶解細(xì)胞膜，并與核酸形成復(fù)合物。該復(fù)合物在高鹽溶液中（>0.7MNaCl）是可溶的，通過有機(jī)溶劑抽提，去除蛋白、多糖、多酚等雜質(zhì)后加入乙醇沉淀即可使核酸分離出來。SDS法：適用于細(xì)菌、血液、酵母、動(dòng)物組織、細(xì)胞等。SDS是一種陰離子去污劑，可溶解細(xì)胞膜，裂解細(xì)胞，使蛋白質(zhì)變性、染色體解體。其它裂解方法：物理方式：機(jī)械剪切、超聲波破碎、研磨勻漿等化學(xué)方式：異硫氰酸胍、堿裂解等酶法：蛋白酶K3、DNA分離純化純化要求：核酸樣品中不應(yīng)存在對(duì)酶（如核酸內(nèi)切酶、DNA聚合酶等）有YZ作用的成分。其它生物大分子如蛋白質(zhì)、多糖、多酚和脂類分子等污染應(yīng)降低到Zdi程度。排除其它核酸分子的污染，如提DNA時(shí)應(yīng)去除RNA，反之亦然。純化方法：細(xì)胞破碎后，常使用吸附材料結(jié)合方法去除雜質(zhì)和純化DNA，主要有硅基質(zhì)材料、陰離子交換樹脂和磁珠等。因硅基質(zhì)材料可特異吸附核酸DNA，使用方便、快捷，不需要使用有毒溶劑如酚、氯仿等，使得提取基因組像過濾一樣簡(jiǎn)單，因此硅基質(zhì)材料成為大規(guī)模分離純化DNA的通用方法。硅基質(zhì)材料吸附核酸的原理：主要利用DNA在高鹽低pH值環(huán)境下與硅基質(zhì)材料相結(jié)合，在低鹽高pH值環(huán)境下與硅基質(zhì)材料脫離的特征。其機(jī)理可能是高濃度鹽離子破壞了硅基質(zhì)水分子結(jié)構(gòu)，形成陽離子橋，當(dāng)鹽被清除后，再水化的硅石破壞了基質(zhì)和DNA之間的吸引力，因而DNA從硅基質(zhì)上被洗脫下來。注意事項(xiàng)：盡量簡(jiǎn)化操作步驟，縮短提取過程，以減少各種有害因素對(duì)核酸的破壞。減少化學(xué)物質(zhì)對(duì)DNA的降解，為避免過酸、過堿對(duì)DNA雙鏈中磷酸二酯鍵的破壞，操作多在pH值4.0-10.0的條件下進(jìn)行。防止基因組DNA的生物降解，主要是DNase降解基因組DNA，DNase需二價(jià)金屬陽離子如Mg2+等的激活，可用EDTA等金屬離子螯合劑螯合Mg2+以YZDNase的活性。減少物理因素對(duì)DNA的降解，物理降解因素主要包括機(jī)械剪切力（如劇烈振蕩、攪拌等），細(xì)胞突然置于低滲液中導(dǎo)致的細(xì)胞爆炸式破裂，DNase大量釋放，樣品反復(fù)凍融和高溫等。4、DNA洗脫收集DNA的洗脫效率取決于以下重要因素：洗脫液成分：采用硅基質(zhì)膜吸附的DNA，可將DNA在低鹽高pH值條件下洗脫下來。pH值在7.0-8.5之間洗脫效率較高，pH值低于7.0則洗脫效率很低。一般基因組提取試劑盒中的洗脫緩沖液就是TE（pH8.0），既為DNA從硅基質(zhì)膜上洗脫下來提供良好的pH環(huán)境，其中的EDTA又能保證DNA不被DNase降解，同時(shí)由于EDTA濃度非常低，對(duì)核酸內(nèi)切酶、DNA聚合酶的影響非常微弱，不影響后續(xù)實(shí)驗(yàn)，可放心使用。洗脫液體積：當(dāng)洗脫液體積小于30ul時(shí)，洗脫效率很低且不穩(wěn)定；當(dāng)洗脫液體積在50-200ul時(shí)，洗脫效率穩(wěn)定在80-90，并可保證得到Zda產(chǎn)量，因此洗脫液體積不能小于30ul。加洗脫液部位：100-200ul洗脫液能完全覆蓋硅基質(zhì)膜，DNA的洗脫量可得到保證，但當(dāng)洗脫液體積較少如30-50ul時(shí)，須在硅基質(zhì)膜中間部分懸空滴加洗脫液，以確保少量的洗脫液能完全覆蓋硅膠膜。洗脫液的溫度：在加洗脫液之前，先將洗脫液在60-75℃水浴中預(yù)熱10分鐘，可有效提高DNA的洗脫效率。洗脫時(shí)間和次數(shù)：加入預(yù)熱的洗脫液后，可在室溫放置2-5分鐘使DNA完全溶解在洗脫液里通過離心而洗脫下來。同時(shí)可進(jìn)行二次或三次洗脫，即將前次洗脫下來的洗脫液再上柱、離心，使前次沒有洗脫下來的DNA再次溶解在洗脫液里，從而提高DNA的產(chǎn)量。5、DNA的定量及檢測(cè)提取得到的DNA*片段需從分子質(zhì)量、濃度、純度等方面進(jìn)行檢測(cè)，從而判斷DNA質(zhì)量。用瓊脂糖凝膠電泳分析DNA分子質(zhì)量：得到的基因組DNA*片段的大小與樣品保存時(shí)間、操作過程中的剪切力等因素有關(guān)。Solarbio公司的基因組DNA提取試劑盒提取的不同材料基因組DNA*片段大小一般在50kb左右，能很好地滿足后續(xù)試驗(yàn)的要求。通常用瓊脂糖凝膠電泳分析DNA分子質(zhì)量時(shí)，以溴酚藍(lán)為示蹤染料，EB染色，紫外觀察，并與DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照即可判斷所提DNA的平均分子量。高質(zhì)量的基因組DNA應(yīng)顯示為單一條帶，如DNA降解則表現(xiàn)為彌散條帶。用紫外分光光度計(jì)檢測(cè)DNA濃度和純度：濃度測(cè)定：DNA在OD260處有顯著吸收峰，OD260值為1相當(dāng)于大約50ug/ml雙鏈DNA。以下簡(jiǎn)單介紹OD260的測(cè)定方法：所提基因組DNA樣品=100ul進(jìn)行OD260值測(cè)定的待測(cè)樣品=20ul所提基因組DNA樣品+180ulTE=200ulDNA稀釋倍數(shù)=200ul/20ul=10倍如200ul待測(cè)樣品OD260值=0.2待測(cè)樣品濃度（即100ul基因組DNA樣品濃度）=50ug/ml×OD260值×稀釋倍數(shù)=100ug/ml所提100ul基因組DNA樣品總量=100ug/ml×100ul=10ugDNA純度測(cè)定：一般用OD260/OD280值檢測(cè)DNA樣品的純度。正常OD260/OD280值約為1.7-1.9，說明DNA純度較好；若OD260/OD280值小于1.7，說明可能有蛋白污染；若OD260/OD280值大于2.0，說明可能有RNA污染或DNA已經(jīng)降解。注：因?yàn)閜H值和離子會(huì)影響光吸收值，因此洗脫時(shí)如不使用洗脫緩沖液，而使用去離子水，OD260/OD280值會(huì)偏低，但并不表示純度低。6、DNA的儲(chǔ)存儲(chǔ)存溶液：DNA為兩性解離分子，在堿性條件下較穩(wěn)定，因此一般用TE（pH8.0）保存。TE的成分為：10mMTris-HCl（Tris與鹽酸形成強(qiáng)的緩沖對(duì)）；1mMEDTA（乙二胺四乙酸，能螯合二價(jià)金屬陽離子，YZDNase的活性）；pH8.0（堿性條件可減少DNA的脫氨作用，防止降解）。ddH2O的正常pH值為7.0，可作為DNA的儲(chǔ)存液，但有些實(shí)驗(yàn)室制備的ddH2O呈酸性（pH值小于7.0），這不僅影響DNA的洗脫效率，而且導(dǎo)致長(zhǎng)時(shí)間保存的DNA容易發(fā)生降解。因此建議用TE作為DNA的長(zhǎng)期儲(chǔ)存液。儲(chǔ)存條件：為避免DNA降解，提取的DNA應(yīng)先進(jìn)行分裝，然后置于-20℃或-70℃保存，同時(shí)注意避免反復(fù)凍融造成DNA降解。[詳細(xì)]

  2024-09-29 11:52

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  2015-11-25 00:00

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