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小鼠熱休克蛋白40(Hsp-40)ELISA試劑盒
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2013-12-09 00:00 284閱讀次數(shù)
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小鼠熱休克蛋白40(Hsp-40)ELISA試劑盒
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小鼠熱休克蛋白40(Hsp-40)ELISA試劑盒
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2013-12-09 00:00
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- 小鼠熱休克蛋白90(HSP-90)檢測試劑盒說明書該試劑盒以HRP標記的鏈霉親和素復(fù)合物(HRPStreptavidinConjugate,HRP-SA)為基礎(chǔ),可用于檢測血液,細胞、組織內(nèi)的特異性CD40抗原。該試劑盒具有靈敏度高、特異性強、定性定位準確、背景清晰。在所用的CD40一抗與相應(yīng)靶抗原結(jié)合后,用生物化二抗與一抗特異性結(jié)合,Z后加入HRP-SA,形成抗原特異一抗生物素化二抗HRP-SA復(fù)合物,顯微鏡下觀察成像。小鼠熱休克蛋白90(HSP-90)檢測試劑盒所含試劑:試劑A通透液:0.1%Triton-X10010mL(選用)試劑B封閉緩沖液(封閉用)20mL試劑C(原裝進口分裝)已稀釋的即用型CD40一抗(2.5ml)試劑D(原裝進口分裝)生物素化羊抗兔IgG1支(濃度1.5mg/mL,稀釋比為1:300~1:500)50μL+抗體稀釋液20ml試劑EHRP-SA復(fù)合物1支(濃度1μM,稀釋比1:50~1:200)100μL試劑FDAB顯色液5ml用戶自備試劑:1.10mMTBS(pH7.2~7.4)三羥基氨基甲烷1.21g氯化鈉7.6g加蒸餾水800mL,濃鹽酸調(diào)pH值至7.2~7.4,Z后定容至1000mLTBS-T:TBS+Tween20(0.05%體積比)2.抗原修復(fù)液(依檢測抗原不同而選擇不同的修復(fù)液)10mMpH6.0檸檬酸緩沖液檬酸0.38g檸檬酸三鈉2.45g加蒸餾水900mL,濃鹽酸調(diào)pH值至6.0,Z后定容至1000mL或:0.5MEDTA修復(fù)液(pH8.0)EDTA2H2O186.1g加蒸餾水700mL,用10mMNaOH調(diào)pH值至8.0,Z后定容至1000Ml3.緩沖甘油封固劑10mL4.Tween205mL石蠟包埋組織切片免疫染色實驗步驟(建議方案):石蠟包埋組織切片3~4μm厚度1.烤片:將待做切片置于切片架上,于60℃恒溫烤箱中至少烤1hr;2.脫蠟:切片放入盛有二甲苯的容器中脫蠟3次(即二甲苯Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ),每次10min;3.水化:切片經(jīng)下行酒精水化,無水乙醇5min,95%乙醇2次(每次2min),85%乙醇2min;75%乙醇2min,自來水沖洗,ddH2O洗2×2min;4.抗原修復(fù):根據(jù)抗體說明書推薦方法進行抗原修復(fù),常采用高壓、微波(溫度達到98~100℃)或酶消化修復(fù)法,室溫自然冷卻,自來水沖洗,ddH2O洗2×2min,TBS洗滌(2×2min)(具體修法見附1)*注:有些抗原勿需修復(fù),直接進入第5步封閉。5.封閉:滴加試劑B,37℃濕盒孵育30min;6.加一抗:滴加用試劑C(即用型一抗),37℃濕盒孵育2hr7.洗滌:TBS-T洗滌(3×5min);8.封閉:滴加試劑B,37℃濕盒孵育10min;9.加二抗:滴加用抗體稀釋液稀釋的生物素化二抗(試劑D),37℃濕盒中孵育30min;10.洗滌:TBS-T洗滌(3×5min);11.封閉:滴加試劑Tween20,37℃濕盒孵育封閉20min;12.加HRP-SA:滴加用試劑C稀釋的試劑E(1:50~200,終濃度5~20nM),37℃濕盒中孵育30min;13.洗滌:TBS-T洗滌(3×5min),TBS洗滌(2×5min);14.顯色:應(yīng)用DAB溶液(試劑F)顯色;15.復(fù)染:自來水充分沖洗,復(fù)染,脫水,透明;16.封片:待組織標本干后,用試劑緩沖甘油封固劑封片;17.觀察成像:顯微鏡下觀察成像。原特異一抗生物素化二抗HRP-SA復(fù)合物,顯微鏡下觀察成像。小鼠熱休克蛋白90(HSP-90)檢測試劑盒注意事項:1.修復(fù)后緩沖液須自然冷卻,自來水沖洗后方能把切片取出,驟冷有可能導(dǎo)致結(jié)晶或抗原封閉。2.緩沖液的量必須保證所有切片都能浸泡到,用過的檸檬酸緩沖液不能反復(fù)使用。3.若試劑為微量濃縮液,用前應(yīng)低速離心,將內(nèi)蓋和管壁附著的溶液離到底部。4.封片前一定要換用TBS充分洗滌,以便洗去組織上殘留的Tween20,否則會影響結(jié)果觀察。5.如須復(fù)染細胞核,則在封片前復(fù)染或直接采用含有染核試劑的封片劑進行封片。附1:抗原修法常用抗原修復(fù)液:檸檬酸緩沖液(0.01MpH6.0)、EDTA抗原修復(fù)液(pH8.0或9.0)等等。一、酶消化修復(fù)法酶消化修復(fù)切片脫蠟水化處理,TBS沖洗,在組織上滴加胃蛋白酶或胰蛋白酶,37℃孵育20~30min后TBS沖洗即可。二、微波抗原修復(fù)法微波盒中加入抗原修復(fù)液微波加熱至沸騰,將脫蠟水化后的切片置于耐高溫塑料切片架上,放入已沸騰的緩沖液中,中檔或繼續(xù)微波10~15min,取出微波盒冷卻至室溫后,自來水沖洗,取出切片。因不同微波爐微波處理時間存在差異,須自行調(diào)整。三、直接高壓抗原修復(fù)法取修復(fù)液于不銹鋼高壓鍋中加熱至沸騰,將組織切片置于耐高溫切片架上,修復(fù)液沸騰后放入切片架,蓋上鍋蓋,待噴氣后計時1.5~2.5min即可脫離熱源,自然冷卻至室溫后自來水沖洗,取出切片。此方法適用于較難檢測或核抗原的修復(fù)。四、隔水式高壓抗原修復(fù)法不銹鋼高壓鍋中加自來水加熱至沸騰,微波盒中加入修復(fù)液于微波爐中加熱至沸騰,將切片放入微波盒中,再將微波盒放入高壓鍋中蓋上鍋蓋,待噴氣后計時4~8min即可關(guān)閉熱源,自然冷卻至室溫后自來水沖洗,取出切片。此方法適用于較難檢測或核抗原的修復(fù)。[詳細]
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