本文由 上海驪葆科學(xué)儀器有限公司 整理匯編

2012-12-28 00:00 1358閱讀次數(shù)

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  LexA酵母雙雜交系統(tǒng)簡(jiǎn)介一、LexA酵母雙雜交系統(tǒng)的設(shè)計(jì)原理報(bào)告質(zhì)粒p8op-LacZ的GAL4UAS編碼序列被完全去除，因此在缺乏LexA融合激活劑的情況下，報(bào)告基因LacZ的轉(zhuǎn)錄活性為零，該基因的篩選標(biāo)志為URA3，可以作為有自主復(fù)制能力的質(zhì)粒存在于酵母EGY48菌株中，也可以被整合到EGY48基因組DNA上。質(zhì)粒pLexA的篩選標(biāo)志為HIS3，在雙雜交系統(tǒng)中用于表達(dá)DNA-BD（202個(gè)氨基酸殘基組成的LexA蛋白）與目標(biāo)蛋白（釣餌，Bait）的融合蛋白，該融合體的表達(dá)受酵母強(qiáng)啟動(dòng)子ADH1的調(diào)控，選擇與報(bào)告基因的操縱子LexA×8結(jié)合。質(zhì)粒pB42AD的篩選標(biāo)志為T(mén)RP1，在其供外源基因插入的多克隆位點(diǎn)（EcoRI與XhoI）上游，含有SV40核定位（SV40nuclearlocalization）、HA（血凝素）及AD（來(lái)自于E.coli的88個(gè)氨基酸殘基組成的B42蛋白）等幾種編碼序列，共同組成可以啟動(dòng)報(bào)告基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)的激活成份。在酵母EGY48的基因組中還整合有另一個(gè)報(bào)告基因Leu，它與LacZ報(bào)告基因具有相同的操縱子-LexA，但兩者啟動(dòng)子不同。根據(jù)雙雜交系統(tǒng)的原理，如果某一復(fù)合物同時(shí)具有DNA-BD和AD的活性，即可激活報(bào)告基因的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)。分別將待測(cè)蛋白X、Y的編碼序列插入pLexA質(zhì)粒載體和pB42AD質(zhì)粒載體的多克隆位點(diǎn)中，然后共同轉(zhuǎn)入含有報(bào)告基因的酵母菌株，如果蛋白X與Y能相互作用，則啟動(dòng)報(bào)告基因的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)，通過(guò)檢測(cè)報(bào)告基因的表達(dá)情況，就可以間接反映蛋白X、Y是否具有相互作用以及作用的強(qiáng)弱。如果將蛋白Y換為取自組織或血液的cDNA文庫(kù)，則可用X從該文庫(kù)中篩選出能與其相互作用的蛋白，并且可以獲得編碼這些蛋白的cDNA。二、商品化酵母雙雜交系統(tǒng)的組成1.載體質(zhì)粒：pLexA、pB42AD、p8op-LacZ、pB42AD-DNA文庫(kù)2.酵母菌株：EGY48、EGY48（p8op-LacZ）、YM4271（EGY48的伴侶菌株）3.大腸桿菌菌株：E.coliKC8株4.對(duì)照質(zhì)粒：質(zhì)粒用途pLexA-53，pB42AD-T陽(yáng)性對(duì)照pLexA-Pos（LexA/GAL4AD融合蛋白〕陽(yáng)性對(duì)照pLexA-Lam（LaminC蛋白少與其它蛋白相互作用）假陽(yáng)性檢測(cè)質(zhì)粒5.引物：pLexA測(cè)序引物及pB42AD測(cè)序引物。三、酵母雙雜交實(shí)驗(yàn)的基本流程1.將報(bào)告基因p8op-LacZ轉(zhuǎn)化酵母EGY48菌株，用培養(yǎng)基SD/-Ura篩選。2.同時(shí)構(gòu)建或擴(kuò)增DNA文庫(kù)，并純化足夠的質(zhì)粒以轉(zhuǎn)化酵母細(xì)胞。3.構(gòu)建DNA-BD/靶蛋白質(zhì)粒pLexA-X，作為釣餌（bait）。4.將上述釣餌質(zhì)粒pLexA-X轉(zhuǎn)化EGY48（p8op-LacZ）細(xì)胞株，用SD/-His/-Ura篩選;并用固體誘導(dǎo)培養(yǎng)基SD/Gal/Raf/-His/-Ura檢測(cè)此DNA-BD/靶蛋白是否具有直接激活報(bào)告基因的活性，以及對(duì)酵母細(xì)胞是否具有殺傷毒性。轉(zhuǎn)化質(zhì)粒選擇培養(yǎng)基克隆生長(zhǎng)情況說(shuō)明（含有Gal/Raf）pLexA-PosSD/-His，-Ura藍(lán)陽(yáng)性對(duì)照pLexASD/-His，-Ura白陰性對(duì)照PlexA-XSD/-His，-Ura白沒(méi)有直接激活活性PlexA-XSD/-His，-Ura藍(lán)具有直接激活活性PlexA-XSD/-His，-Ura菌落不能生長(zhǎng)酵母細(xì)胞毒性4-1.如果pLexA-X-半乳糖苷酶的信號(hào)作用。b能夠自動(dòng)激活報(bào)告基因，則設(shè)法去除其激活活性部位、或者將LacZ報(bào)告基因整合入基因組，減少4-2.如果pLexA-X雖然不會(huì)自動(dòng)激活報(bào)告基因，但對(duì)酵母宿主細(xì)胞有毒性，則需要與純化的文庫(kù)DNA同時(shí)轉(zhuǎn)化酵母。5.如果pLexA-X既不會(huì)自動(dòng)激活報(bào)告基因，也不具有毒性，則可以與純化的文庫(kù)DNA同時(shí)、或順序轉(zhuǎn)化酵母細(xì)胞，并檢測(cè)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化效率。轉(zhuǎn)化質(zhì)粒SD固體培養(yǎng)基LacZ表型對(duì)照1pLexA-PosGal/Raf/-His/-Ura藍(lán)對(duì)照2pLexA-53Gal/Raf/-His/-Trp/-Ura/-Leu藍(lán)+pB42AD-T實(shí)驗(yàn)pLexA-XGal/Raf/-His/-Trp/-Ura/-Leu待測(cè)+pB42AD-文庫(kù)5-1.用SD/-His/-Trp/-Ura培養(yǎng)基選擇陽(yáng)性共轉(zhuǎn)化子，并擴(kuò)增，使宿主細(xì)胞中的質(zhì)粒在誘導(dǎo)前達(dá)到Zda拷貝數(shù)。-半乳糖苷酶無(wú)表達(dá)。b5-2.上述重組子轉(zhuǎn)至含X-gal的固體誘導(dǎo)培養(yǎng)基SD/Gal/Raf/-His/-Trp/-Ura/-Leu，觀(guān)察LacZ及Leu報(bào)告基因的表達(dá)情形，藍(lán)色克隆即為陽(yáng)性。白色克隆為假陽(yáng)性，說(shuō)明Leu雖有表達(dá)，但5-3.同時(shí)用LacZ、Leu兩個(gè)報(bào)告基因的目的，是為了盡可能消除實(shí)驗(yàn)的假陽(yáng)性誤差，譬如：AD融合蛋白不與目標(biāo)蛋白結(jié)合，而直接與啟動(dòng)子序列結(jié)合域結(jié)合等情況。由于2個(gè)報(bào)告基因的啟動(dòng)子不同，出現(xiàn)上述假陽(yáng)性的幾率就大大減少了。5-4.將藍(lán)色陽(yáng)性克隆進(jìn)行1次以上的劃種，盡可能分離克隆中的多種文庫(kù)質(zhì)粒。6.陽(yáng)性克隆的篩選6-1.隨機(jī)選取50個(gè)陽(yáng)性克隆，擴(kuò)增、抽提酵母質(zhì)粒，電轉(zhuǎn)化E.coliKC8宿主菌，抽提大腸桿菌中的質(zhì)粒，酶切鑒定是否具有插入片段及排除相同的文庫(kù)質(zhì)粒。6-2.如果重復(fù)的插入序列較多，可另取50個(gè)陽(yáng)性克隆來(lái)分析。Z后得到數(shù)種片段大小不同的插入序列，再轉(zhuǎn)化新的宿主細(xì)胞，檢測(cè)是否仍為陽(yáng)性克隆。7.用質(zhì)粒自然分選法（NaturalSegregation）篩除只含有AD-文庫(kù)雜合子的克隆7-1.將初步得到的陽(yáng)性克隆接種SD/-Trp/-Ura液體培養(yǎng)基，培養(yǎng)1-2天，含有HIS3編碼序列的BD-靶質(zhì)粒在含有外源His培養(yǎng)基中，將以10%-20%左右的頻率隨機(jī)丟失。C孵育2-3天?！?-2.將上述克隆，轉(zhuǎn)鋪固體培養(yǎng)基SD/-Trp/-Ura，307-3.再挑取生長(zhǎng)的單克隆，轉(zhuǎn)入SD/-Trp/-Ura和SD/-His/-Trp/-Ura培養(yǎng)基中，篩選His表型缺陷的克隆，即得到只含有AD-文庫(kù)雜合子的重組子。7-4.將His表型缺陷的克隆轉(zhuǎn)化固體誘導(dǎo)培養(yǎng)基SD/Gal/Raf/-Trp/-Ura，以驗(yàn)證AD-文庫(kù)能否直接激活報(bào)告基因的表達(dá)，棄去陽(yáng)性克隆，保留陰性克隆。8.酵母雜合試驗(yàn)（YeastMating）確定真陽(yáng)性克隆如下表所示，在酵母EGY48及其對(duì)應(yīng)的YM4271宿主細(xì)胞中分別轉(zhuǎn)入相應(yīng)的質(zhì)粒或文庫(kù)DNA，通過(guò)雜合實(shí)驗(yàn)確篩選pLexA-靶DNA與pB42AD-文庫(kù)確實(shí)具有相互作用的真陽(yáng)性克隆。質(zhì)粒1（inYM4271）質(zhì)粒2（inEGY48）LacZ表型Leu表型pLexApB42AD白不能生長(zhǎng)pLexA-靶DNApB42AD白不能生長(zhǎng)pLexApB42AD-文庫(kù)白不能生長(zhǎng)pLexA-靶DNApB42AD-文庫(kù)藍(lán)真陽(yáng)性pLexA-LampB42AD-文庫(kù)白不能生長(zhǎng)9.陽(yáng)性克隆的進(jìn)一步篩選和確證9-1.擴(kuò)增初步確定的陽(yáng)性克隆，抽提酵母DNA。該DNA為混合成份，既含有酵母基因組DNA，也含有3種轉(zhuǎn)化的質(zhì)粒DNA。9-2.將上述DNA電轉(zhuǎn)化E.coliKC8宿主菌。由于在大腸桿菌中，具有不同復(fù)制起始調(diào)控序列的質(zhì)粒不相容;同時(shí)利用營(yíng)養(yǎng)缺陷型篩選。因此，在M9/SD/-Trp培養(yǎng)基上，只有含有AD-文庫(kù)質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化菌才能生長(zhǎng)，將其擴(kuò)增、并抽提質(zhì)粒DNA，酶切鑒定。9-3.用pLexA-靶DNA與pB42AD-庫(kù)DNA一一對(duì)應(yīng)、共轉(zhuǎn)化只含有報(bào)告基因的酵母菌EGY48中，先到SD/-His/-Trp/-Ura板擴(kuò)增，并與后面的誘導(dǎo)板形成對(duì)照，說(shuō)明報(bào)告基因的表達(dá)與誘導(dǎo)AD融合蛋白的表達(dá)有關(guān)，再確證LacZ、Leu報(bào)告基因的表達(dá)。9-4.擴(kuò)增與靶DNA相互作用的文庫(kù)DNA，進(jìn)行序列分析及進(jìn)一步的結(jié)構(gòu)、功能研究。10.對(duì)雙雜交系統(tǒng)陽(yáng)性結(jié)果的進(jìn)一步研究10-1.用不同的雙雜交系統(tǒng)驗(yàn)證10-1-1.將載體pLexA與pB42AD互換后進(jìn)行雙雜交實(shí)驗(yàn)。10-1-2.選擇不同的雙雜交系統(tǒng)，如：以GAL4轉(zhuǎn)錄激活子為基礎(chǔ)的雙雜交系統(tǒng)。10-1-3.將文庫(kù)質(zhì)粒移碼突變后，再與靶質(zhì)粒作用，報(bào)告基因是否仍能被激活。-半乳糖苷酶水平，比較作用強(qiáng)度變化。b10-1-4.去除或突變特定結(jié)合位點(diǎn)，定量檢測(cè)10-2.用試劑盒提供的引物測(cè)定插入片段的DNA序列，證明其編碼區(qū)域。10-3.用其它的檢測(cè)方法，如：親和色譜法或免疫共沉淀法來(lái)證明雙雜交系統(tǒng)篩選的蛋白之間的具有相互作用。10-4.進(jìn)一步研究靶蛋白與篩選蛋白之間的功能關(guān)系構(gòu)建于AD載體的cDNA文庫(kù)的擴(kuò)增1.自-80℃冰箱取出含有cDNA文庫(kù)的甘油菌，置于冰浴中緩慢化凍。2.用新鮮的LB培養(yǎng)液在1.5ml離心管中將上述甘油菌1:106和1:108稀釋。lml加入90m3.取稀釋菌液各1090mm）;37℃倒置培養(yǎng)過(guò)夜或30℃培養(yǎng)24-36hr，計(jì)數(shù)平板上單克隆菌落數(shù)。fLB培養(yǎng)液在1.5ml離心管中振蕩混勻，涂布LB/Amp平板（4.確定待擴(kuò)增的cDNA文庫(kù)滴度（cfu/ml）=克隆數(shù)×108（1:106稀釋?zhuān)┗蚩寺?shù)×1010（1:108稀釋?zhuān)?.按照>150mm），共100塊;37℃倒置培養(yǎng)過(guò)夜。f2-4×104cfu/平板的濃度，涂布LB/Amp平板（6.在超凈工作臺(tái)上，在所有生長(zhǎng)菌落的平板上加適量LB培養(yǎng)液，將菌落刮下，轉(zhuǎn)入2000mlLB/Amp培養(yǎng)液中，37℃振蕩培養(yǎng)2-4hr。7.留取適量培養(yǎng)菌液以50%無(wú)菌甘油稀釋至25%終濃度，分裝，保存于-80℃。8.其余培養(yǎng)菌液離心8000xg×10min，4℃收集細(xì)菌;用質(zhì)粒DNA純化試劑盒大量抽提質(zhì)粒DNA。LB液體培養(yǎng)基，121℃，15lb/in2滅菌15minA.bacto-Tryptone10.0gB.bacto-YeastExtract5.0gC.NaCl10.0gD.ddH2O→1000ml*LB固體培養(yǎng)平板為含有1.5%瓊脂（Agar）LB培養(yǎng)基。**LB/Amp培養(yǎng)基為含有Ampg/ml的LB培養(yǎng)基。m50-100構(gòu)建于AD載體的cDNA文庫(kù)的純化1.質(zhì)粒DNA提取緩沖液名稱(chēng)緩沖液配方g/mlRNasemP1懸浮緩沖液50mMTris-HCl（pH8.0）;10mMEDTA;100AP2裂解緩沖液200mMNaOH;1%SDSP3中和緩沖液3.0MKac（pH5.5）QBT平衡緩沖液750mMNaCl;50mMMOPS（pH7.0）;15%異丙醇;0.15%TritonX-100QC洗滌緩沖液1.0MNaCl;50mMMOPS（pH7.0）;15%異丙醇QF洗脫緩沖液1.25MNaCl;50mMTris-HCl（pH8.5）;15%異丙醇2.培養(yǎng)菌液離心6000xg×10min，4℃，每500ml培養(yǎng)物（下同）的沉淀重懸于50mlP1緩沖液。3.加入50mlP2緩沖液，倒置4-6次混勻，室溫孵育5min。4.加入4℃預(yù)冷的50mlP3緩沖液，快速倒置4-6次混勻，冰浴30min（其間再倒置混勻4-6次）。5.將上述混合液再倒置混勻，離心12000xg×30min，4℃，保留上清。6.上清再離心12000xg×15min，4℃，留上清。7.將上清液上樣于經(jīng)35mlQBT緩沖液平衡的QIAGEN-tip層析柱。8.以100mlQC緩沖液洗滌層析柱2次。9.以35mlQF緩沖液洗脫吸附于層析柱上的DNA。10.以0.7倍體積異丙醇沉淀DNA，離心12500xg×30min，4℃，小心去除上清。11.以7ml70%乙醇洗滌沉淀DNA，離心12500xg×10min，4℃，小心去除上清。12.將沉淀的質(zhì)粒DNA溶于5mlTE（pH8.0）緩沖液，轉(zhuǎn)移至新的無(wú)菌離心管中，用2.5倍體積無(wú)水乙醇;1/10體積3.0MNaAc（pH5.2），于-20℃靜置過(guò)夜。13.離心12500xg×20min，4℃，去除上清，沉淀用70%乙醇洗滌，超凈臺(tái)風(fēng)干。l），保存于-20℃。mg/管（用于1次轉(zhuǎn)化反應(yīng)，約40m14.干燥的DNA溶于適量體積TE，定量，分裝100-200構(gòu)建于DNA-BD載體的目的DNA轉(zhuǎn)化酵母感受態(tài)細(xì)胞1.將酵母菌EGY48（p8op-lacZ）接種于5.0mlSD/-Ura液體培養(yǎng)基中，緩振打散菌落，然后轉(zhuǎn)入95.0mlSD/-Ura液體培養(yǎng)基中，30℃恒溫，250rpm振蕩培養(yǎng)16-18hr，至OD600>1.0。SD/-Ura液體培養(yǎng)基，115℃，10lb/in2滅菌15minA.DifcoNitrogen0.67gB.葡萄糖2.00gC.10×DO（-His，-Leu，-Trp，-Ura）10.0mlD.20×His5.0mlE.20×Leu5.0mlF.20×Trp5.0mlG.ddH2O→100.0ml2.將上述新鮮培養(yǎng)菌液接種于300mlYPD，至OD600=0.2-0.3（約50ml），30℃恒溫，250rpm振蕩培養(yǎng)至OD600=0.4-0.5（約3hr）。YPD液體培養(yǎng)基，115℃，10lb/in2滅菌15minA.Polypepton6.0gB.bacto-YeastExtract3.0gC.葡萄糖6.0gD.ddH2O→300ml3.室溫離心5000xg×5min，棄上清;加入15-25mlddH2O重懸洗滌沉淀酵母細(xì)胞，離心棄上清，沉淀用1×TE/LiAc重懸后，即為酵母感受態(tài)細(xì)胞。4.準(zhǔn)備下列試劑2×轉(zhuǎn)化反應(yīng)10×TE10×LiAc50%PEGddH2Olml/120ml15mA.1×TE/LiAc0.15ml15l/ml960ml120mB.PEG/LiAc1.20ml120lml//900mC.1×TE1.00ml1005.分裝待轉(zhuǎn)化的質(zhì)粒DNA，振蕩混勻。lmg）3-5mA.pLexA-X（0.1B.10mg/mllmSpermDNA*（0.1mg）10*新配制時(shí)水浴煮沸20min后，插入冰浴，保存于-20℃。l用1×TE/LiAc重懸的酵母感受態(tài)細(xì)胞，振蕩混勻。m6.每管加入100lm7.各加入600PEG/LiAc，振蕩混勻，30℃恒溫，250rpm振蕩培養(yǎng)30min。lm8.各加入70DMSO緩和倒置混勻。42℃熱休克15min，迅速插入冰浴。9.室溫離心13000xg×10sec，盡量棄上清;以0.3ml1×TE重懸沉淀細(xì)胞，涂布SD/-Ura，-His固體培養(yǎng)板，30℃倒置培養(yǎng)3-5天。SD/-Ura，-His固體培養(yǎng)基，115℃，10lb/in2滅菌15min稍冷卻后鋪板A.DifcoNitrogen1.34gB.葡萄糖4.00gC.10×DO（-His，-Leu，-Trp，-Ura）20.0mlD.20×Leu10.0mlE.20×Trp10.0mlF.Agar4.00gG.ddH2O90-100mm）f→200.0ml鋪8-10塊平板（附表1.不同規(guī)模轉(zhuǎn)化酵母感受態(tài)細(xì)胞SmallScale*LargeScaleLibraryScale轉(zhuǎn)化反應(yīng)2011（1）SD液體培養(yǎng)基擴(kuò)增酵母菌100ml100ml300ml（2）YPD液體培養(yǎng)基擴(kuò)增酵母菌300mla300mla1000mla（3）TE或ddH2O洗滌酵母細(xì)胞15mlc25-50mlb500mla（4）準(zhǔn)備A.1×TE/LiAc緩沖液1.5mld1.0mld8.0mlcB.PEG/LiAc緩沖液12.0mlc6.0mlc100.0mlbC.1×TE緩沖液6.0mlc10.0mlc10.0mlc（5）分裝A.DNA-BDvectorgd×20/0.2-1.0mgcm0.1gd0.1-0.5mgmg×2010-50mB.ADvector0.1C.l2.0mlml×20200mSpermDNA（10mg/ml）101×TE/LiAc重懸感受態(tài)細(xì)胞1.5mlc1.0mlc8.0mlbl×201.0ml8.0mlm酵母感受態(tài)細(xì)胞100（7）PEG/LiAc緩沖液0.6ml×206.0ml60.0mll7.0mlml×20700mDMSO70（9）室溫離心后棄上清13000xg×10sec2000xg×5min2000xg×5min（10）1×TE重懸感受態(tài)細(xì)胞0.3ml×206.0ml10.0ml150mm×50f150mm×30f90mm×20f鋪固體選擇培養(yǎng)基平板注:*即為“構(gòu)建于DNA-BD載體的目的DNA轉(zhuǎn)化酵母感受態(tài)細(xì)胞”**在不同容積的無(wú)菌離心管中進(jìn)行，a:300或500ml;b:50ml;c:15ml;d:1.5ml文庫(kù)cDNA轉(zhuǎn)化含有DNA-BD載體的酵母感受態(tài)細(xì)胞1.以生長(zhǎng)于SD/-Ura，-His固體培養(yǎng)板上的含有構(gòu)建于DNA-BD載體的目的DNA及報(bào)告基因（p8op-lacZ）的酵母菌EGY48作為宿主菌，制備酵母感受態(tài)細(xì)胞。2.將酵母宿主菌接種于5.0mlSD/-Ura，-His液體培養(yǎng)基中，緩振打散菌落，然后轉(zhuǎn)入95.0mlSD/-Ura，-His液體培養(yǎng)基中，30℃恒溫，250rpm振蕩培養(yǎng)16-18hr，至OD600>1.0。SD/-Ura，-His液體培養(yǎng)基，115℃，10lb/in2滅菌15minA.DifcoNitrogen0.67gB.葡萄糖2.00gC.10×DO（-His，-Leu，-Trp，-Ura）10.0mlD.20×Leu5.0mlE.20×Trp5.0mlF.ddH2O→100.0ml3.將上述新鮮培養(yǎng)菌液接種于300mlYPD，至OD600=0.2-0.3（約50ml），30℃恒溫，250rpm振蕩培養(yǎng)至OD600=0.4-0.5（約3hr）。YPD液體培養(yǎng)基，115℃，10lb/in2滅菌15minA.Polypepton6.0gB.bacto-YeastExtract3.0gC.葡萄糖6.0gD.ddH2O→300ml4.室溫離心5000xg×5min，棄上清;加入15-25mlddH2O重懸洗滌沉淀酵母細(xì)胞，離心棄上清，沉淀用1×TE/LiAc重懸后，即為酵母感受態(tài)細(xì)胞。5.準(zhǔn)備下列試劑1×轉(zhuǎn)化反應(yīng)10×TE10×LiAc50%PEGddH2Olml/800ml100mA.1×TE/LiAc1.0ml100l4.8ml/ml600mB.PEG/LiAc6.0ml600C.1×TE10.0ml1.0ml//9.0ml6.取1.0ml用1×TE/LiAc重懸的酵母感受態(tài)細(xì)胞，加入下列成份，振蕩混勻。lmg）40mA.pB42AD-Library（50-100B.10mg/mllmHerringDNA*（2.0mg）200*新配制時(shí)水浴煮沸20min后，插入冰浴，保存于-20℃。7.加入6.0mlPEG/LiAc，振蕩混勻，30℃恒溫，250rpm振蕩培養(yǎng)30min。lm8.加入700DMSO緩和倒置混勻。42℃熱休克15min，迅速插入冰浴。9.室溫離心2000xg×5min，盡量棄上清。10.以6.0ml100mm，每稀釋度各×2），30℃倒置培養(yǎng)3-5天，確定轉(zhuǎn)化效率在2×106cfu以上有效。fl稀釋不同倍數(shù)，涂布SD/-Ura，-His，-Trp固體培養(yǎng)板（m1×TE重懸沉淀細(xì)胞，取10150mm×30），30℃倒置培養(yǎng)3-5天。fl涂布SD/-Ura，-His，-Trp固體培養(yǎng)板（m11.按每板200SD/-Ura，-His，-Trp固體培養(yǎng)基，115℃，10lb/in2滅菌15min稍冷卻后鋪板A.DifcoNitrogen13.40gB.葡萄糖40.00gC.10×DO（-His，-Leu，-Trp，-Ura）200.0mlD.20×Leu100.0mlE.Agar40.00gF.ddH2O150mm）f→2000.0ml鋪30塊平板（12.在超凈工作臺(tái)上，在所有生長(zhǎng)菌落的平板上各加5mlTE（pH7.0）緩沖液，將菌落刮下。13.離心棄上清，加入10-20mlTE緩沖液重懸沉淀菌，加入等體積的無(wú)菌65%甘油-MgSO4緩沖液，混勻，分裝1.0ml/管，保存于4℃1周或-80℃1年以上。65%甘油-MgSO4緩沖液:65%甘油;100mMMgSO4;25mMTris-HCl（pH8.0）A.甘油65.00mlB.MgSO47H2O2.465gC.2.0MTris-HCl（pH8.0）1.25mlD.ddH2O→100.00ml酵母雙雜合系統(tǒng)陽(yáng)性克隆的篩選1.經(jīng)過(guò)選擇培養(yǎng)基篩選的含有DNA-BD載體、文庫(kù)DNA及報(bào)告基因的酵母感受態(tài)細(xì)胞，用無(wú)菌TE稀釋至1:104、1:106和1:108等不同濃度。90mm），30℃倒置培養(yǎng)3-5天，計(jì)數(shù)平板上單克隆菌落數(shù)。fl，涂布SD/-Ura，-His，-Trp固體培養(yǎng)板（m2.取上述稀釋菌液各1003.確定待進(jìn)一步鑒定的酵母菌滴度（cfu/ml）=克隆數(shù)×105（1:104稀釋?zhuān)?、克隆?shù)×107（1:106稀釋?zhuān)┗蚩寺?shù)×109（1:108稀釋?zhuān)?.按照以前實(shí)驗(yàn)確定的文庫(kù)轉(zhuǎn)化效率的5-10倍的總量、0.5-2×106cfu/平板的菌量，涂布SD/Gal/Raf/-Ura，-His，-Trp，-Leu固體誘導(dǎo)培養(yǎng)板，30℃倒置培養(yǎng)3-5天。5.挑取顯藍(lán)色的菌落，再接種于SD/-Ura，-His，-Trp固體培養(yǎng)基以及SD/Gal/Raf/-Ura，-His，-Trp，-Leu固體誘導(dǎo)培養(yǎng)基，以進(jìn)一步確證。SD/Gal/Raf/-Ura，-His，-Trp，-Leu固體誘導(dǎo)培養(yǎng)基A.SD/Gal/Raf3.79gB.10×DO（-His，-Leu，-Trp，-Ura）10.0mlC.Agar2.00gD.ddH2O→85.0ml滅菌（115℃，10lb/in2）15min，冷卻至50℃，加入下列成份后鋪板E.10×BU10.0mlF.20mg/mlX-gal0.4ml90-100mm）f鋪5-6塊平板（10×BU緩沖液，121℃，15lb/in2滅菌15minA.Na2HPO412H2O9.30gB.NaH2PO42H2O3.90gC.ddH2O→100.0ml20mg/mlX-GalA.X-Gal40mgB.DMF2ml酵母雙雜合系統(tǒng)陽(yáng)性克隆的鑒定-酵母質(zhì)粒DNA的提取1.挑取經(jīng)過(guò)酵母選擇/誘導(dǎo)培養(yǎng)基初步鑒定的酵母單菌落，接種于5.0-10.0mlSD/-Trp液體培養(yǎng)基，30℃恒溫，250rpm振蕩培養(yǎng)20hr。SD/-Trp液體培養(yǎng)基，115℃，10lb/in2滅菌15minA.DifcoNitrogen0.67gB.葡萄糖2.00gC.10×DO（-His，-Leu，-Trp，-Ura）10.0mlD.20×His5.0mlE.20×Leu5.0mlF.20×Ura5.0mlG.ddH2O→100.0ml2.室溫離心5000xg×1min，棄上清，收菌。l酵母裂解液，振蕩重懸沉淀酵母菌。m3.加入200酵母裂解液:2%TritonX-100;1%SDS;100mMNaCl;10mMTris-HCl（pH8.0）;1mMEDTAA.10%TritonX-10020.0mlB.10%SDS10.0mlC.NaCl0.58gD.Tris0.12gE.EDTANa22H2O0.04gF.1.0MHCl調(diào)pH8.0G.ddH2O→100.0ml4.加入下列試劑，充分振蕩5min;液氮凍存10min，室溫復(fù)融;再充分振蕩5min。A.經(jīng)酸處理的玻璃珠（Sigma）0.20gB.苯酚:氯仿:異戊醇（25:24:1）0.2ml5.室溫離心12000xg×10min，將上清轉(zhuǎn)移至新的1.5ml離心管中，加入下列試劑，于-70℃凍存30-60min。A.3MNaAc（1/10lmV）20lmB.無(wú)水乙醇（2.5V）5006.離心12500xg×10min，4℃，棄上清;70%乙醇洗滌沉淀，于37℃烘箱或超凈臺(tái)干燥DNA;將干燥的沉淀DNA重溶于l無(wú)菌ddH2O中，保存于-20℃。m20-30酵母雙雜合系統(tǒng)陽(yáng)性克隆的鑒定-酵母質(zhì)粒DNA電轉(zhuǎn)化大腸桿菌1.在冰浴條件下，取待轉(zhuǎn)化DNAl感受態(tài)細(xì)胞中，混勻。mg），加入100ml（5pg-0.5m1.0WF，200m2.將上述混合液加入間距0.1cm的樣品杯中，電轉(zhuǎn)化（1.8kV，25。3.迅速加入1ml新鮮的LB培養(yǎng)液，混勻，轉(zhuǎn)入1.5ml離心管中，37℃恒溫，150rpm振蕩孵育30-60min。4.將上述轉(zhuǎn)化反應(yīng)液涂布M9/DO（-Trp）固體培養(yǎng)板，37℃倒置培養(yǎng)至單菌落出現(xiàn)（16-22hr）。5.按常規(guī)方法擴(kuò)增上述陽(yáng)性轉(zhuǎn)化菌，堿裂解法少量抽提質(zhì)粒DNA，酶切篩選AD載體上含有插入片段的陽(yáng)性克隆，保存其于25%甘油，待進(jìn)一步驗(yàn)證。M9/DO-Trp固體培養(yǎng)基，115℃，10lb/in2滅菌15minA.葡萄糖1.2gB.Agar6.0gC.5×M9緩沖液60mlD.10×DO（-His，-Leu，-Trp，-Ura）30mlE.20×His15mlF.20×Leu15mlG.20×Ura15mlH.ddH2O165ml冷卻至50℃左右，加入下列成份，混勻鋪板I.1.0MThiamine-HCl（Vit.B1）0.3mlJ.100mg/mlAmp0.3ml90-100mm）f鋪10-15塊平板（大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞的制備（電轉(zhuǎn)化）1.挑取LB固體培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的E.coliKC8單菌落，接種于5mlLB液體培養(yǎng)基中，37℃恒溫，250rpm振蕩培養(yǎng)過(guò)夜（約12-14hr）。2.將2.5ml新鮮菌液接種于500mlSOB培養(yǎng)液中，37℃恒溫，250rpm振蕩培養(yǎng)至OD600=0.5-0.6（約2.5-3hr）。SOB液體培養(yǎng)基，115℃，10lb/in2滅菌15minA.bacto-Tryptone10.00gB.bacto-YeastExtract2.50gC.NaCl0.25gD.KCl0.09gE.MgCl26H2O1.02gF.ddH2O→500.0ml3.將培養(yǎng)菌液收集于離心管中，冰水浴15-20min。4.離心6000xg×10min，4℃，棄盡上清;以5ml預(yù)冷的無(wú)菌ddH2O重懸沉淀菌;再加入500ml預(yù)冷的無(wú)菌ddH2O洗滌細(xì)菌。5.重復(fù)上述步驟1次，以充分去除培養(yǎng)基中殘余的鹽離子成份。6.用40-50ml預(yù)冷的無(wú)菌10%甘油重懸沉淀細(xì)菌，轉(zhuǎn)移至50ml無(wú)菌離心管中;離心6000xg×10min，4℃，棄盡上清;重復(fù)此步驟1次。7.以等體積（約1.5-2.0ml）預(yù)冷的無(wú)菌10%甘油重懸上述沉淀的感受態(tài)細(xì)胞，分裝0.5ml/管（5-6次轉(zhuǎn)化反應(yīng)），保存于-80℃?zhèn)溆?。酵母雙雜合系統(tǒng)陽(yáng)性克隆的確證1.以含有報(bào)告基因（p8op-lacZ）的酵母菌EGY48作為轉(zhuǎn)化宿主菌。2.將酵母宿主菌接種于5.0mlSD/-Ura液體培養(yǎng)基中，緩振打散菌落，然后轉(zhuǎn)入95.0mlSD/-Ura液體培養(yǎng)基中，30℃恒溫，250rpm振蕩培養(yǎng)16-18hr，至OD600>1.0。SD/-Ura液體培養(yǎng)基，115℃，10lb/in2滅菌15minA.DifcoNitrogen0.67gB.葡萄糖2.00gC.10×DO（-His，-Leu，-Trp，-Ura）10.0mlD.20×His5.0mlE.20×Leu5.0mlF.20×Trp5.0mlG.ddH2O→100.0ml3.將上述新鮮培養(yǎng)菌液接種于300mlYPD，至OD600=0.2-0.3（約50ml），30℃恒溫，250rpm振蕩培養(yǎng)至OD600=0.4-0.5（約3hr）。YPD液體培養(yǎng)基，115℃，10lb/in2滅菌15minA.Polypepton6.0gB.bacto-YeastExtract3.0gC.葡萄糖6.0gD.ddH2O→300ml4.室溫離心5000xg×5min，棄上清;加入15-25mlddH2O重懸洗滌沉淀酵母細(xì)胞，離心棄上清，沉淀用1×TE/LiAc重懸后，即為酵母感受態(tài)細(xì)胞。5.準(zhǔn)備下列試劑20×轉(zhuǎn)化反應(yīng)10×TE10×LiAc50%PEGddH2Ol/1.2mlml150mA.1×TE/LiAc1.5ml150B.PEG/LiAc12.0ml1.2ml1.2ml9.6ml/C.1×TE10.0ml1.0ml//9.0ml6.分裝待轉(zhuǎn)化的質(zhì)粒DNA。A.pLexAlmg）3-5morpLexA-X（0.1lmg）3-5mB.pB42AD-Y（0.1C.10mg/mlSpermlmDNA*（0.1mg）10*新配制時(shí)水浴煮沸20min后，插入冰浴，保存于-20℃。l用1×TE/LiAc重懸的酵母感受態(tài)細(xì)胞，振蕩混勻。m7.每管加入100lm8.各加入600PEG/LiAc，振蕩混勻，30℃恒溫，250rpm振蕩培養(yǎng)30min。lm9.各加入70DMSO緩和倒置混勻。42℃熱休克15min，迅速插入冰浴。10.室溫離心13000xg×10sec，盡量棄上清;以0.3ml1×TE重懸沉淀細(xì)胞，涂布SD/-Ura，-His，-Trp固體培養(yǎng)板，30℃倒置培養(yǎng)3-5天。SD/-Ura，-His，-Trp固體培養(yǎng)基，115℃，10lb/in2滅菌15min稍冷卻后鋪板A.DifcoNitrogen3.35gB.葡萄糖10.00gC.10×DO（-His，-Leu，-Trp，-Ura）50.0mlD.20×Leu25.0mlE.Agar10.00gF.ddH2O→500.0ml90-100mm）f鋪20-25塊平板（11.挑取上述固體培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的含有目的DNA（X）的pLexA-X（+）或空載pLexA（-）單菌落，分別接種SD/Gal/Raf/-Ura，-His，-Trp，-Leu固體誘導(dǎo)培養(yǎng)板，30℃倒置培養(yǎng)3-5天。SD/Gal/Raf/-Ura，-His，-Trp，-Leu固體誘導(dǎo)培養(yǎng)基A.SD/Gal/Raf3.79gB.10×DO（-His，-Leu，-Trp，-Ura）10.0mlC.Agar2.00gD.ddH2O→85.0ml滅菌（115℃，10lb/in2）15min，冷卻至50℃，加入下列成份后鋪板E.10×BU10.0mlF.20mg/mlX-gal0.4ml90-100mm）f鋪5-6塊平板（12.選擇含有pLexA-X顯藍(lán)色，而相應(yīng)的不含有插入DNA的空載pLexA顯白色的克隆，擴(kuò)增其在E.coliKC8中的甘油菌，按常規(guī)抽提質(zhì)粒DNA，進(jìn)行序列分析。10×DO（-His，-Trp，-Leu，-Ura）為不含His，Trp，Leu，Ura等成份的10×Dropout溶液。每1000ml溶液中含有下列成份，用ddH2O配制后保存于4℃。（1）L-IsoleucineL-異亮氨酸300mg（2）L-ValineL-纈氨酸1500mg（3）Adenine腺嘌呤200mg（4）L-ArginineHClL-精氨酸200mg（5）L-LysineHClL-賴(lài)氨酸鹽酸鹽300mgL-MethionineL-甲硫氨酸200mg（7）L-PhenylalanineL-苯丙氨酸500mgL-ThreonineL-蘇氨酸2000mg（9）L-TyrosineL-酪氨酸300mg20×氨基酸儲(chǔ)存液每100ml溶液中分別含有下列成份，配制后保存于4℃。20×HisL-HistidineL-組氨酸40mg20×TrpL-TryptophanL-色氨酸40mg20×LeuL-LeucineL-白氨酸200mg20×UraUracil尿嘧啶40mg酵母轉(zhuǎn)化緩沖液:緩沖液體積緩沖液配制10×TE100mlTris1.21g;EDTANa22H2O0.37g;ddH2O80ml;鹽酸調(diào)pH7.5;ddH2O定容10×LiAc100mlLiAc2H2O10.20g;ddH2O50ml，冰醋酸調(diào)pH7.5;ddH2O定容50%PEG100mlPEG335050.0g;ddH2O定容其它緩沖液:緩沖液體積緩沖液配制TE1000mlTris1.21g;EDTANa22H2O0.37g;ddH2O800ml;鹽酸調(diào)pH;ddH2O定容STE1000mlNaCl5.84g;Tris1.21g;EDTANa22H2O0.37g;ddH2O800ml;鹽酸調(diào)pH8.0;ddH2O定容[詳細(xì)]

  2018-10-12 10:00

  產(chǎn)品樣冊(cè)

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• 鼠尾基因組提取試劑盒說(shuō)明書(shū)

  鼠尾基因組提取試劑盒說(shuō)明書(shū)[詳細(xì)]

  2016-05-25 00:00

  實(shí)驗(yàn)操作

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• 電子吊磅使用技巧

  關(guān)于電子吊磅使用技巧大家都知道嗎？電子吊磅也是屬于一種電子產(chǎn)品，所以，我們?cè)谑褂玫臅r(shí)候也要對(duì)它多多注意，千萬(wàn)不能亂操作，不然，可能會(huì)由于我們的亂操作而導(dǎo)致電子吊磅損壞。如果大家對(duì)于電子吊磅使用技巧還不太熟悉的，那今天就有福利啦！小編今天就來(lái)給大家分享一篇文章，保證大家在看完之后一定會(huì)明白的。需要了解更多詳細(xì)信息的朋友大家可以點(diǎn)擊，便可得到您想要知道的東西。文件是純屬免費(fèi)下載的，大家可以放心下載使用，感謝您的支持！相關(guān)文章推薦：電子吊磅基本常識(shí)[詳細(xì)]

  2018-10-11 10:00

  產(chǎn)品樣冊(cè)

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• 高低溫濕熱試驗(yàn)箱特點(diǎn)和濕球紗布安裝技巧

  高低溫濕熱試驗(yàn)箱特點(diǎn)和濕球紗布安裝技巧[詳細(xì)]

  2013-01-30 00:00

  選購(gòu)指南

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• 防爆電子吊鉤秤維修和養(yǎng)護(hù)小技巧

  有很多用戶(hù)在使用防爆電子吊鉤秤的時(shí)候可能不太了解就會(huì)造成一下?lián)p壞。如果我們?cè)谑褂眠^(guò)程中多注意一些細(xì)節(jié)，注意維護(hù)和保養(yǎng)是可以大大延長(zhǎng)防爆電子吊鉤秤的使用壽命的。防爆電子吊鉤秤故障檢查方法在維修工作中故障檢查方法正確與否對(duì)迅速準(zhǔn)確判定故障所在位置并加以修復(fù)是十分重要的。秤的檢修人員在熟悉計(jì)價(jià)秤的操作、結(jié)構(gòu)原理的基礎(chǔ)上，還必須能正確的使用測(cè)量?jī)x表，掌握計(jì)價(jià)秤的基本修理方法。下面介紹幾種常用的故障檢查方法：1.直觀(guān)法在電子吊鉤秤的主線(xiàn)路板上元件較多，有許多故障的發(fā)生是由于短路、斷路、接插出接觸不良，部件管角開(kāi)焊等原因造成的。因此，當(dāng)計(jì)價(jià)秤出現(xiàn)故障以后，應(yīng)首先用直觀(guān)的感覺(jué)：視、聽(tīng)、聞、觸等方法對(duì)線(xiàn)路板進(jìn)行檢查。2.電壓測(cè)量法電子吊鉤秤通過(guò)對(duì)電路元件、芯片各個(gè)管角的工作電壓的測(cè)量與正常值進(jìn)行比較，電壓變化較大的地方就是故障的所在地方。3.短路和開(kāi)路法短路法就是將電路的某一部分短路，電子吊鉤秤然后通過(guò)示波器或萬(wàn)用表測(cè)試的結(jié)果來(lái)判斷故障點(diǎn)。開(kāi)路法就是將電路的某一部分?jǐn)嚅_(kāi)，然后通過(guò)萬(wàn)用表來(lái)測(cè)量電阻、電壓或電流來(lái)判斷故障點(diǎn).注意事項(xiàng)嚴(yán)禁雨淋或用水沖洗，若不慎沾水則用干布擦拭干凈，當(dāng)機(jī)器功能不正常時(shí)要盡速送修。嚴(yán)禁敲打撞擊及重壓。勿置放在高溫及潮濕環(huán)境場(chǎng)所，專(zhuān)用防水防腐秤除外。勿讓蟑螂或小生物侵入機(jī)內(nèi)，以免造成損壞。電子吊鉤秤若長(zhǎng)期不用時(shí)須將機(jī)器擦拭干凈，放入干燥劑用塑料袋包好。使用干電池的應(yīng)取出，使用充電蓄電池時(shí)，應(yīng)每隔三個(gè)月充電一次，以確保使用壽命。定期校正為保持磅秤的準(zhǔn)確性，應(yīng)至少一年校正一次。校正方式可委托信譽(yù)良好的磅秤店、實(shí)驗(yàn)室或政府檢定單位實(shí)施。若廠(chǎng)內(nèi)使用，亦可購(gòu)置一套適合本身且檢驗(yàn)合格的標(biāo)準(zhǔn)砝碼做定期校正。防爆電子吊鉤秤日常維護(hù)及檢修（1）保持電子吊鉤秤整機(jī)清潔。電子吊鉤秤是一種精密的計(jì)量器具，保持整機(jī)清潔，對(duì)延長(zhǎng)其使用壽命，提高計(jì)量精度有著重要意義。要保持電子吊鉤秤各部位不積塵土和油污，保持各活動(dòng)關(guān)節(jié)靈活自如，防止銹蝕現(xiàn)象，在多塵和有腐蝕氣體等惡劣環(huán)境下使用更應(yīng)及時(shí)清塵、保潔。經(jīng)常檢查有無(wú)碰撞、裂紋，各部位緊固件有無(wú)松動(dòng)，如有異常應(yīng)及時(shí)處理。（2）避免電子吊鉤秤受劇烈推動(dòng)和碰撞、沖擊力。電子吊鉤秤內(nèi)部由許多電子元器件組成，如集成電路、石英晶體、顯示器件、傳感器等，當(dāng)電子吊鉤秤受到劇烈外力時(shí)，可能會(huì)損壞這些元、配件，造成電子吊鉤秤故障，影響精度以致影響正常使用，要避免秤體和其它物品強(qiáng)烈碰撞或從高空摔下，顯示儀表要輕拿輕放，精心管理，不可在強(qiáng)陽(yáng)光下長(zhǎng)時(shí)間爆曬，以防不必要的損失，稱(chēng)重顯示器固定在振動(dòng)較劇烈的地方時(shí)，要采取減振措施，以免影響其可靠性。（3）不要隨意拆卸上的零部件電子吊鉤秤正常使用過(guò)程中，不要隨意拆卸電子吊鉤秤上的零部件，更不要拆卸傳感器的密封和儀表上的集成電路等元件，必要的維修，必須在有關(guān)技術(shù)人員的指導(dǎo)下或具備一定的維修知識(shí)后進(jìn)行，以防故障擴(kuò)大。（4）電子吊鉤秤的管理。電子吊鉤秤屬精密貴重儀器，建議用戶(hù)制定必要的管理制度，實(shí)行專(zhuān)人、專(zhuān)管、專(zhuān)用，建立必要的使用和維修記錄，長(zhǎng)期不用要定點(diǎn)存放，防曬、防潮、防塵。（5）電池組要及時(shí)充電.電子吊鉤秤配備的電池組是可充的蓄電池，其容量有限，長(zhǎng)期不用或工作中顯示欠電指示時(shí)，應(yīng)及時(shí)給電池充電，以免電池過(guò)度放電，影響電池使用壽命，要經(jīng)常檢查電池包裝是否破損，引線(xiàn)是否完好，以防短路、損壞電池及電子吊鉤秤電路。我司專(zhuān)業(yè)銷(xiāo)售各類(lèi)：電子吊鉤秤，電子地磅稱(chēng)，鋼瓶秤，地磅秤，數(shù)顯測(cè)力儀，叉車(chē)電子稱(chēng)等產(chǎn)品哦！詳情請(qǐng)關(guān)注實(shí)干。[詳細(xì)]

  2018-10-07 10:04

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• 金相樣品制備和分析中的技巧及方法

  金相樣品制備和分析中的技巧及方法[詳細(xì)]

  2024-09-20 00:04

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• wan能材料試驗(yàn)機(jī)的保養(yǎng)方法和技巧

  wan能材料試驗(yàn)機(jī)的保養(yǎng)方法和技巧[詳細(xì)]

  2024-09-20 20:57

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  尾水管流動(dòng)不穩(wěn)定性的實(shí)驗(yàn)研究[詳細(xì)]

  2024-09-18 18:05

  實(shí)驗(yàn)操作

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• 實(shí)驗(yàn)操作禁忌及技巧

  實(shí)驗(yàn)操作禁忌及技巧[詳細(xì)]

  2009-09-22 00:00

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• 真空烘箱的使用技巧

  真空烘箱的使用技巧[詳細(xì)]

  2011-09-16 00:00

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• 氣相色譜儀出現(xiàn)異常維護(hù)技巧

  氣相色譜儀出現(xiàn)異常維護(hù)技巧[詳細(xì)]

  2011-12-21 00:00

  標(biāo)準(zhǔn)

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