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酶標(biāo)儀檢測(cè)飼料中嘔吐毒素的方案！
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2018-11-18 10:00 863閱讀次數(shù)
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酶標(biāo)儀檢測(cè)飼料中嘔吐毒素是基于競(jìng)爭(zhēng)性酶聯(lián)免疫吸附檢測(cè)法。用水震蕩萃取粉碎樣品中的DON,過(guò)濾水相萃取物，然后進(jìn)行免疫學(xué)檢測(cè)。加入嘔吐毒素的酶標(biāo)記物到已加有標(biāo)準(zhǔn)或樣品的測(cè)試孔中，抗體被加入后反應(yīng)開(kāi)始，樣品及酶標(biāo)記物競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合連接在微孔上的抗體，10分鐘培養(yǎng)后，倒掉孔中的溶液，洗掉微孔中未結(jié)合的嘔吐毒素和酶標(biāo)記物。加入無(wú)色的底物溶液，培養(yǎng)5分鐘，所有結(jié)合的酶標(biāo)記物使底物轉(zhuǎn)化成藍(lán)色物質(zhì)。加入停止液然后讀取吸光度值，未知濃度樣品與標(biāo)準(zhǔn)吸光度值進(jìn)行比較，就可以得到樣品的嘔吐毒素濃度。
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酶標(biāo)儀檢測(cè)飼料中嘔吐毒素的方案！- 酶標(biāo)儀檢測(cè)飼料中嘔吐毒素是基于競(jìng)爭(zhēng)性酶聯(lián)免疫吸附檢測(cè)法。用水震蕩萃取粉碎樣品中的DON,過(guò)濾水相萃取物，然后進(jìn)行免疫學(xué)檢測(cè)。加入嘔吐毒素的酶標(biāo)記物到已加有標(biāo)準(zhǔn)或樣品的測(cè)試孔中，抗體被加入后反應(yīng)開(kāi)始，樣品及酶標(biāo)記物競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合連接在微孔上的抗體，10分鐘培養(yǎng)后，倒掉孔中的溶液，洗掉微孔中未結(jié)合的嘔吐毒素和酶標(biāo)記物。加入無(wú)色的底物溶液，培養(yǎng)5分鐘，所有結(jié)合的酶標(biāo)記物使底物轉(zhuǎn)化成藍(lán)色物質(zhì)。加入停止液然后讀取吸光度值，未知濃度樣品與標(biāo)準(zhǔn)吸光度值進(jìn)行比較，就可以得到樣品的嘔吐毒素濃度。[詳細(xì)]
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嘔吐毒素（vomitoxin）檢測(cè)說(shuō)明書(shū)- 嘔吐毒素（vomitoxin）酶聯(lián)免疫分析（ELISA）試劑盒使用說(shuō)明書(shū)本試劑盒僅供研究使用1使用目的：本試劑盒用于各種谷物、飼料、麥芽啤酒和麥芽汁中嘔吐毒素（vomitoxin）殘留的定量檢測(cè)。2實(shí)驗(yàn)原理本試劑盒采用競(jìng)爭(zhēng)ELISA方法，在微孔板包被有嘔吐毒素（vomitoxin）偶聯(lián)抗原，加入嘔吐毒素（vomitoxin）標(biāo)準(zhǔn)品或樣品，游離嘔吐毒素（vomitoxin）與微孔條上預(yù)包被的嘔吐毒素（vomitoxin）偶聯(lián)抗原互相競(jìng)爭(zhēng)抗嘔吐毒素（vomitoxin）抗體酶標(biāo)記物，用TMB底物顯色，加入終止液后顏色由藍(lán)色變?yōu)辄S色，用酶標(biāo)儀在450nm波長(zhǎng)下進(jìn)行檢測(cè)，吸光值與樣品中嘔吐毒素（vomitoxin）含量成反比，通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品中嘔吐毒素（vomitoxin）的含量。3試劑盒組成3.1預(yù)包被的嘔吐毒素（vomitoxin）偶聯(lián)抗原的可拆酶標(biāo)板：1塊（12孔×8條）。3.2嘔吐毒素（vomitoxin）標(biāo)準(zhǔn)品：6瓶（1ml/瓶），含量分別是：0ppb，0.1ppb,0.3ppb,0.9ppb,2.7ppb,8.1ppb。3.3抗嘔吐毒素（vomitoxin）抗體酶結(jié)合物：1瓶（6ml）。3.4顯色液A：1瓶（6ml）。3.5顯色液B：1瓶（6ml）。3.6終止液：1瓶（6ml），2M硫酸。3.7樣本稀釋液：1瓶（10×,6ml），用于樣品稀釋用。3.8濃縮洗滌液：1瓶（20×，20ml），用于洗板。3.9說(shuō)明書(shū)一份。4需要而未提供的材料4.1設(shè)備4.1.1波長(zhǎng)450nm酶標(biāo)儀。4.1.2粉碎機(jī)。4.1.3量筒。4.1.4振蕩器。4.1.5漏斗。4.1.6WhatmanNo1或相當(dāng)?shù)臑V紙。4.1.7微量移液器。4.2試劑4.2.1去離子水或蒸餾水。4.2.2甲醇。5貯存5.1試劑盒貯存于2~8℃，切勿冷凍5.2未用完的微孔板應(yīng)該密封干燥保存6注意事項(xiàng)6.1使用試劑盒前請(qǐng)仔細(xì)閱讀說(shuō)明書(shū)。6.2不要使用過(guò)期試劑盒。6.3試劑盒使用前，將試劑恢復(fù)至室溫（25±2℃），建議至少回溫2小時(shí)。6.4標(biāo)準(zhǔn)品中含有嘔吐毒素（vomitoxin），使用時(shí)應(yīng)特別注意，操作時(shí)應(yīng)帶手套。6.5終止液中含有硫酸，使用時(shí)防止灼傷皮膚及腐蝕衣物。6.6不同標(biāo)準(zhǔn)品、樣品所用吸頭不能混用，否則會(huì)影響試驗(yàn)結(jié)果。6.7不同批號(hào)試劑盒中的試劑不得混用；不同標(biāo)準(zhǔn)品、樣品所用吸頭不得混用，否則會(huì)影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果。6.8稀釋樣本時(shí)必須用本試劑盒中的樣本稀釋液，否則會(huì)影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果6.9混合試劑時(shí)應(yīng)避免起泡。7工作液準(zhǔn)備7.1嘔吐毒素（vomitoxin）標(biāo)準(zhǔn)品溶液：0ppb，0.1ppb,0.3ppb,0.9ppb,2.7ppb,8.1ppb7.2濃縮洗滌液：用蒸餾水按1:20（1+19）稀釋備用7.3樣本稀釋液：用蒸餾水按1:10（1+9）稀釋備用7.3顯色劑：已備用，避免光線直照7.4反應(yīng)終止液：已備用8樣品處理：（樣品在提取過(guò)程中，要嚴(yán)格按說(shuō)明書(shū)操作，提取過(guò)程中應(yīng)準(zhǔn)確稀釋，否則會(huì)出現(xiàn)結(jié)果不準(zhǔn)確，樣品應(yīng)當(dāng)保存在陰涼避光之處及冷藏保存）一般樣品處理8.1取10g粉碎的樣品，加20ml70%甲醇溶液8.2QL振蕩3分鐘8.3用WhatmanNo1濾紙過(guò)濾8.4取100l處理后的樣品，加入400l樣本稀釋液8.5取100μl稀釋液進(jìn)行分析動(dòng)物組織前處理8.6準(zhǔn)確稱取1±0.05g勻漿后的組織樣品到50ml的聚苯乙烯離心管中；加入3ml乙腈--丙酮提取溶液，2000rpm劇烈震蕩20s后4000r/min以上離心5min8.7取上清液0.8ml在50℃氮?dú)饬飨麓蹈?.8加入3.2mL樣品稀釋液,750rpm渦旋20s8.9取100ml用于分析飼料前處理方法8.10準(zhǔn)確稱取1±0.05g粉碎飼料樣品到50ml的聚苯乙烯離心管中；加入4ml乙腈，1ml丙酮，2000rpm劇烈震蕩20s后4000r/min以上離心3min8.11取上清液0.7ml在50℃氮?dú)饬飨麓蹈?.12加入2.8mL樣品稀釋液,渦旋20s，混勻后取100ml用于分析牛奶前處理方法8.13取1ml牛奶樣品到5ml聚苯乙烯離心管中；加入4ml樣品稀釋液，混勻后取100ml用于分析奶粉前處理方法8.14準(zhǔn)確稱取0.3g奶粉樣品到7ml的聚苯乙烯離心管中；加入2mlPBS溶液，2ml正己烷，震蕩混勻8.154000r/min以上離心5min，去除有機(jī)層和中間層，取下層溶液100ml到400ml樣品稀釋液8.16混勻后取100ml用于分析9酶免分析步驟9.1實(shí)驗(yàn)須知9.1.1實(shí)驗(yàn)開(kāi)始前請(qǐng)將所有試劑于盒外充分恢復(fù)至室溫（25±2℃），時(shí)間約2小時(shí)?；販刂潦覝兀?5±2℃）后再取出微孔條，多余的微孔條重新密封立即于2~8℃干燥保存注：一定保證回溫充分，否則影響檢測(cè)的極ng確度和準(zhǔn)確度。9.1.2使用后請(qǐng)立即將試劑放回2~8℃保存9.1.3請(qǐng)不要改變分析程序9.1.4請(qǐng)使用極ng確的微量移液器9.1.5操作一旦開(kāi)始，請(qǐng)不要中斷任何程序9.1.6ELISA結(jié)果的可重復(fù)性極大程度的取決于操作程序，請(qǐng)嚴(yán)格按照要求操作9.1.7為避免交叉污染，每個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品和樣品均應(yīng)使用不同的吸頭加樣9.1.8加樣時(shí)請(qǐng)勿讓吸頭接觸微孔中的溶液或內(nèi)表面9.2分析步驟9.2.1預(yù)先進(jìn)行編號(hào)，標(biāo)記B0、標(biāo)準(zhǔn)品和樣品的位置，推薦進(jìn)行雙孔檢測(cè)9.2.2取所需數(shù)量的微孔（微孔條可拆），將多余板條重新密封并立即放回2~8℃保存9.2.3樣品稀釋液、濃縮洗滌液（20×）稀釋成工作液（蒸餾水或去離子水稀釋）9.2.4在B0孔中加入50l0.0ppb標(biāo)準(zhǔn)品溶液9.2.5在各標(biāo)準(zhǔn)孔中加入50μl的標(biāo)準(zhǔn)品溶液9.2.6在各樣品孔中加入50l樣品溶液9.2.7在所有孔中加入50l的抗嘔吐毒素（vomitoxin）抗體酶結(jié)合物9.2.8輕輕晃動(dòng)反應(yīng)板幾秒鐘。9.337℃溫浴30min（溫浴過(guò)程中不時(shí)輕拍反應(yīng)板，可以減少雙孔誤差）9.3.1甩掉孔中液體，用洗液洗滌微孔板5次，Z后一次應(yīng)在吸水紙上拍打以完全除去孔中液體。9.4反應(yīng)9.4.1洗滌程序完成后，立即用微量移液器在每個(gè)微孔中先加入50l顯色液A，再加50l顯色液B；輕微晃動(dòng)反應(yīng)板使之徹底混勻9.4.237℃溫浴10min9.4.3每孔中加入50l終止液，混勻9.4.4在450nm下檢測(cè)吸光度，結(jié)果在5min內(nèi)讀取。10結(jié)果計(jì)算10.1定量分析10.1.1所獲得的每個(gè)濃度標(biāo)準(zhǔn)溶液和樣本吸光度值的平均值（B）除以**個(gè)標(biāo)準(zhǔn)（0標(biāo)準(zhǔn)）的吸光度值（B0）再乘以1**%，即百分吸光度值。B標(biāo)準(zhǔn)溶液或樣本溶液的平均吸光度值B00ppb標(biāo)準(zhǔn)溶液的平均吸光度值10.1.2以嘔吐毒素（vomitoxin）濃度的對(duì)數(shù)值為X軸，百分吸光度值為Y軸，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。根據(jù)樣品百分吸光度值，可從曲線上得到對(duì)應(yīng)點(diǎn)的橫坐標(biāo)，即為嘔吐毒素（vomitoxin）濃度的對(duì)數(shù)值，求得反對(duì)數(shù)即為測(cè)定液中嘔吐毒素（vomitoxin）濃度C（ppb）10.1.3由于樣品經(jīng)過(guò)了預(yù)先稀釋，因此根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線所得出的樣品濃度一定要再乘以其稀釋倍數(shù)。10.2半定量測(cè)定10.1.1目測(cè)半定量測(cè)定：首先選擇一個(gè)適當(dāng)?shù)臉?biāo)準(zhǔn)液與樣品同運(yùn)行，根據(jù)樣品與標(biāo)準(zhǔn)品吸光度值的高低比較，判斷樣品濃度值是小于還是大于標(biāo)準(zhǔn)值。10.1.2儀器半定量測(cè)定：首先選擇一個(gè)適當(dāng)?shù)臉?biāo)準(zhǔn)液與樣品同運(yùn)行，根據(jù)樣品與標(biāo)準(zhǔn)品顏色深淺比較，判斷樣品濃度值是小于還是大于標(biāo)準(zhǔn)值。11特異性物質(zhì)交叉反應(yīng)嘔吐毒素（vomitoxin）1**%12試劑盒參數(shù)本試劑盒檢測(cè)下限為0.1ppbB0吸光度**值應(yīng)大于1.0試劑盒吸光度板內(nèi)誤差小于8％，板間誤差小于15％。用本說(shuō)明書(shū)提供的組織樣本提取方法回收率大于80％。13標(biāo)準(zhǔn)曲線模式（僅供參考）試劑盒提供的標(biāo)準(zhǔn)曲線范圍為0.1ppb~8.1ppb。14分析限制本試劑盒檢測(cè)為陽(yáng)性的樣品應(yīng)該用另一種方法如HPLC或GC/MS加以確證。[詳細(xì)]
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