本文由 賽默飛化學(xué)分析儀器 整理匯編

2008-06-06 00:00 849閱讀次數(shù)

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  增加RT-PCR靈敏度的方法RT--PCR增加RT-PCR靈敏度的方法（一）分離高質(zhì)量RNA成功的cDNA合成來(lái)自高質(zhì)量的RNA。高質(zhì)量的RNA至少應(yīng)保證全長(zhǎng)并且不含逆轉(zhuǎn)錄酶的YZ劑，如EDTA或SDS。RNA的質(zhì)量決定了你能夠轉(zhuǎn)錄到cDNA上的序列信息量的Zda值。一般的RNA純化方法是使用異硫氰酸胍／酸性酚的一步法。Trizol試劑法將一步法加以提高，可以從多種組織和細(xì)胞中提取高質(zhì)量的非降解RNA。Trizol試劑法可以從Z少100個(gè)細(xì)胞或1mg組織中提取RNA。一般不必使用oligo（dT）選擇性分離poly（A）+RNA。不管起始模板是總RNA還是poly（A）+RNA，都可以檢測(cè)到擴(kuò)增結(jié)果。另外，分離poly（A）+RNA會(huì)導(dǎo)致樣品間mRNA豐度的波動(dòng)變化，從而使信息的檢出和定量產(chǎn)生偏差。然而，當(dāng)分析稀有mRNA時(shí)，poly（A）+RNA會(huì)增加檢測(cè)的靈敏度。為了防止痕量RNase的污染，從富含RNase的樣品（如胰臟）中分離到的RNA需要貯存在甲醛中以保存高質(zhì)量的RNA，對(duì)于長(zhǎng)期貯存更是如此。從大鼠肝臟中提取的RNA，在水中貯存一個(gè)星期就基本降解了，而從大鼠中提取的RNA，在水中保存3年仍保持穩(wěn)定。另外，長(zhǎng)度大于4kb的轉(zhuǎn)錄本對(duì)于痕量RNase的降解比小轉(zhuǎn)錄本更敏感。為了增加貯存RNA樣品的穩(wěn)定性，可以將RNA溶解在去離子的甲酰胺中，存于-70℃。用于保存RNA的甲酰胺一定不能含有降解RNA的雜物。來(lái)源于胰臟的RNA至少可以在甲酰胺中保存一年。當(dāng)準(zhǔn)備使用RNA時(shí)，可以使用下列方法沉淀RNA：加入NaCl至0.及4倍體積的乙醇，室溫放置3-5分鐘，10,000×g離心5分鐘。在逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)中經(jīng)常加入RNaseYZ劑以增加cDNA合成的長(zhǎng)度和產(chǎn)量。RNaseYZ劑要在**鏈合成反應(yīng)中，在緩沖液和還原劑（如DTT）存在的條件下加入，因?yàn)閏DNA合成前的過(guò)程會(huì)使YZ劑變性，從而釋放結(jié)合的可以降解RNA的RNase。蛋白R(shí)NaseYZ劑僅防止RNaseA，B，C對(duì)RNA的降解，并不能防止皮膚上的RNase，因此盡管使用了這些YZ劑，也要小心不要從手指上引入RNase。2M（二）使用無(wú)RNaseH活性（RNaseH-）的逆轉(zhuǎn)錄酶逆轉(zhuǎn)錄酶催化RNA轉(zhuǎn)化成cDNA。不管是M-MLV還是AMV，在本身的聚合酶活性之外，都具有內(nèi)源RNaseH活性。RNaseH活性同聚合酶活性相互競(jìng)爭(zhēng)RNA模板與DNA引物或cDNA延伸鏈間形成的雜合鏈，并降解RNA：DNA復(fù)合物中的RNA鏈。被RNaseH活性所降解的RNA模板不能再作為合成cDNA的有效底物，降低了cDNA合成的產(chǎn)量和長(zhǎng)度。因此消除或大大降低逆轉(zhuǎn)錄酶的RNaseH活性將會(huì)大有裨益。SuperScriptⅡ逆轉(zhuǎn)錄酶，RNaseH-的MMLV逆轉(zhuǎn)錄酶及ThermoScript逆轉(zhuǎn)錄酶，RNaseH-的AMV，比MMLV和AMV得到更多量和更多全長(zhǎng)的cDNA。RT-PCR靈敏度會(huì)受cDNA合成量的影響。ThermoScript比AMV的靈敏性強(qiáng)得多。RT-PCR產(chǎn)物的大小受限于逆轉(zhuǎn)錄酶合成cDNA的能力，尤其是克隆較大的cDNA時(shí)。同MMLV相比，SuperScripⅡ顯著提高了長(zhǎng)RT-PCR產(chǎn)物的產(chǎn)量。RNaseH-的逆轉(zhuǎn)錄酶同時(shí)增加了熱穩(wěn)定性，所以反應(yīng)可以在高于正常的37-42℃的溫度下進(jìn)行。在建議的合成條件下，使用oligo（dT）引物和10μCi的[α-P]dCTP。**鏈的總產(chǎn)量使用TCA沉淀法計(jì)算。全長(zhǎng)cDNA使用在堿性瓊脂糖膠上將大小分類(lèi)的條帶切除并計(jì)數(shù)的方法分析。（三）提高逆轉(zhuǎn)錄保溫溫度較高的保溫溫度有助于RNA二級(jí)結(jié)構(gòu)的打開(kāi)，增加了反應(yīng)的產(chǎn)量。對(duì)于多數(shù)RNA模板，在沒(méi)有緩沖液或鹽的條件下，將RNA和引物在65℃保溫，然后迅速置于冰上冷卻，可以消除大多數(shù)二級(jí)結(jié)構(gòu)，從而使引物可以結(jié)合。然而某些模板仍然會(huì)存在二級(jí)結(jié)構(gòu)，即使熱變性后也是如此。對(duì)這些困難模板的擴(kuò)增可以使用ThermoScript逆轉(zhuǎn)錄酶，并將逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)置于較高溫度下進(jìn)行以改善擴(kuò)增。較高的保溫溫度也可以增加特異性，尤其是當(dāng)使用基因特異性引物（GSP）進(jìn)行cDNA合成時(shí)。如果使用GSP，確保引物的Tm值與預(yù)計(jì)的保溫溫度相同。不要在高于60℃時(shí)使用oligo（dT）和隨機(jī)引物。隨機(jī)引物需要在增加到60℃前在25℃保溫10分鐘。除了使用較高的逆轉(zhuǎn)錄溫度外，還可以通過(guò)直接將RNA/引物混合物從65℃變性溫度轉(zhuǎn)到逆轉(zhuǎn)錄保溫溫度，并加入預(yù)熱的2×的反應(yīng)混合物提高特異性（cDNA熱啟動(dòng)合成）。這種方法有助于防止較低溫度時(shí)所發(fā)生的分子間堿基配對(duì)。使用PCR儀可以簡(jiǎn)化RT-PCR所需的多種溫度切換。Tth熱穩(wěn)定聚合酶在Mg2+存在條件下作為DNA聚合酶，在Mn2+存在條件下作為RNA聚合酶。它可以在Z高65℃條件下保溫。然而，PCR過(guò)程中Mn2+的存在會(huì)降低忠實(shí)性，這使得Tth聚合酶不太適合用于高極ng確度的擴(kuò)增，如cDNA的克隆。另外，Tth的逆轉(zhuǎn)錄效率較低，這會(huì)降低靈敏度，而且，既然單個(gè)酶就可以進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄和PCR，那么沒(méi)有逆轉(zhuǎn)錄的對(duì)照反應(yīng)就不能用來(lái)將cDNA的擴(kuò)增產(chǎn)物同污染的基因組DNA的擴(kuò)增產(chǎn)物區(qū)分開(kāi)來(lái)。（四）促進(jìn)逆轉(zhuǎn)錄的添加劑包括甘油和DMSO在內(nèi)的添加劑加到**鏈合成反應(yīng)中，可以減低核酸雙鏈的穩(wěn)定并解開(kāi)RNA二級(jí)結(jié)構(gòu)，Z多可以加入20％的甘油或10％的DMSO而不影響SuperScriptⅡ或MMLV的活性。AMV也可以耐受Z多20％的甘油而不降低活性。為了在SuperScriptⅡ逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)中Zda限度提高RT-PCR的靈敏度，可以加入10％的甘油并在45℃保溫。如果1/10的逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)產(chǎn)物加入到PCR中，那甘油在擴(kuò)增反應(yīng)中的濃度為0.％，這不足以YZPCR。4（五）RNaseH處理在PCR之前使用RNaseH處理cDNA合成反應(yīng)可以提高靈敏度。對(duì)于某些模板，據(jù)認(rèn)為cDNA合成反應(yīng)中的RNA會(huì)阻止擴(kuò)增產(chǎn)物的結(jié)合，在這種情況下，RNaseH處理可以增加靈敏度。一般當(dāng)擴(kuò)增較長(zhǎng)的全長(zhǎng)cDNA目標(biāo)模板時(shí)，RNaseH處理是必需的，比如低拷貝的tuberousscherosisⅡ（圖7）。對(duì)這種困難模板，RNaseH的處理加強(qiáng)了SuperScriptⅡ或AMV合成的cDNA所產(chǎn)生的信號(hào)。對(duì)于多數(shù)RT-PCR反應(yīng)，RNaseH處理是可選的，因?yàn)?5℃保溫的PCR變性步驟一般會(huì)將RNA：DNA復(fù)合物中的RNA水解掉。（六）小量RNA檢測(cè)方法的提高當(dāng)僅有小量RNA時(shí)，RT-PCR尤其具有挑戰(zhàn)性。在RNA分離過(guò)程中加入的作為載體的糖元有助于增加小量樣品的產(chǎn)量。可以在加入Trizol的同時(shí)加入無(wú)RNase的糖元。糖元是水溶性的，可以同RNA保持在水相中以輔助隨后的沉淀。對(duì)于小于50mg的組織或106個(gè)培養(yǎng)細(xì)胞的樣品，無(wú)RNase糖元的建議濃度為250μg/ml。在使用SuperScriptⅡ的逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)中加入乙?；疊SA可以增加靈敏度，而且對(duì)于小量RNA，減少SuperScriptⅡ的量并加入40單位的RnaseOut核酸酶YZ劑可以提高檢測(cè)的水平。如果在RNA分離過(guò)程中使用了糖元，仍然建議在使用SuperScriptⅡ進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)時(shí)加入BSA或RNaseYZ劑。（七）一步法同兩步法RT-PCR的比較兩步法RT-PCR比較常見(jiàn)，在使用一個(gè)樣品檢測(cè)多個(gè)mRNA時(shí)比較有用。然而一步法RT-PCR具有其他優(yōu)點(diǎn)。一步法RT-PCR在處理大量樣品時(shí)易于操作，有助于減少殘余污染，因?yàn)樵赾DNA合成和擴(kuò)增之間不需要打開(kāi)管蓋。一步法可以得到更高的靈敏度，Zdi可以達(dá)到0.總RNA，這是因?yàn)檎麄€(gè)cDNA樣品都被擴(kuò)增。對(duì)于成功的一步法RT-PCR，一般使用反義的基因特異性引物起始cDNA合成1pg[詳細(xì)]

  2024-09-29 07:29

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• 拉力機(jī)與電腦聯(lián)機(jī)失敗的解決方法

  拉力機(jī)與電腦聯(lián)機(jī)失敗的解決方法目前市場(chǎng)上常用的拉力機(jī)都配備一臺(tái)電腦來(lái)控制試驗(yàn)的整個(gè)操作過(guò)程及數(shù)據(jù)的存儲(chǔ)、分析。但是如果拉力機(jī)和電腦聯(lián)機(jī)失敗那么拉伸試驗(yàn)就無(wú)法進(jìn)行，更何談數(shù)據(jù)分析了。因此我們需要掌握正確的聯(lián)機(jī)方法才能杜絕這樣的情況發(fā)生。聯(lián)機(jī)失敗的解決方法大致可以分為兩個(gè)步驟：步驟一：先檢查軟件打開(kāi)軟件是否能正常開(kāi)啟，如果不能說(shuō)明其端口被其它軟件占用或者和電腦系統(tǒng)不兼容。2、聯(lián)機(jī)前關(guān)閉電腦上安裝的殺毒軟件以防和操作軟件沖突。（如：360殺毒、qq管家等）3、然后檢查一下串口線是否與電腦有連接好，檢測(cè)主機(jī)是否通電，查看緊急開(kāi)關(guān)是否壓下。正確操作方法是向右旋轉(zhuǎn)一下，自動(dòng)彈出表示已開(kāi)，這時(shí)可以點(diǎn)機(jī)臺(tái)上的“上升”或“下降”開(kāi)關(guān)，機(jī)臺(tái)是否能動(dòng)。如果能動(dòng)表示機(jī)臺(tái)功能完好，這是可以確保連線沒(méi)有問(wèn)題的情況下，那就可以直接點(diǎn)擊菜單上面的“設(shè)置”-“聯(lián)機(jī)”，這時(shí)候就要選擇連接的COM口直接進(jìn)行聯(lián)機(jī)，要是不知道連接的COM口的話，為了保證聯(lián)機(jī)正確，那么就右擊我的電腦→屬性→設(shè)備管理器查看，選擇對(duì)應(yīng)COM口進(jìn)行聯(lián)機(jī)，直到成功聯(lián)機(jī)為止，如果還不行可以換臺(tái)電腦或串口線試試。步驟二：再檢查硬件聯(lián)機(jī)前檢查拉力機(jī)的電源是否通電。2、檢查電腦硬件驅(qū)動(dòng)是否安裝成功。濟(jì)南普創(chuàng)機(jī)電有限公司一直以客戶需求為導(dǎo)向堅(jiān)持走自主創(chuàng)新之路，以質(zhì)量和科技技術(shù)引領(lǐng)行業(yè)發(fā)展為目的。公司以“專注檢測(cè)理論研究，以客戶需求”為價(jià)值ZX，矢志不渝的為用戶提供Z可信賴的服務(wù)。[詳細(xì)]

  2018-11-03 10:00

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• 【資料下載】使用高內(nèi)涵激光成像系統(tǒng)提高 復(fù)雜生物檢測(cè)的靈敏度、速度 和分析質(zhì)量

  隨著高度復(fù)雜的基于細(xì)胞的二維和三維分析技術(shù)在生物研究中的應(yīng)用日益廣泛，人們迫切需要提高自動(dòng)化高內(nèi)涵成像能力。在此，我們展示了使 用 ImageXpress?Confocal HT.ai 高內(nèi)涵成像系統(tǒng)在檢測(cè)靈敏度、分析質(zhì)量和采集速度方面的提升。使用高功率激光光源，該系統(tǒng)可顯著增加樣品的光通量，從而產(chǎn)生更明亮的圖像、更高的靈敏度和更高的檢測(cè)通量。這種影響對(duì)于靈敏度和成像時(shí)間是限制因素的檢測(cè)尤其重要。為了證明激光光源的實(shí)際影響，我們展示了幾個(gè)復(fù)雜生物學(xué)的檢測(cè)系統(tǒng)結(jié)果：GPCR 活化檢測(cè)、腫瘤細(xì)胞球和肺類(lèi)器官。[詳細(xì)]

  2024-09-15 17:53

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• 大體積不銹鋼杜瓦瓶

  大體積不銹鋼杜瓦瓶[詳細(xì)]

  2015-01-06 00:00

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• 稱重傳感器靈敏度解說(shuō)

  當(dāng)我們?cè)谶x購(gòu)稱重傳感器的時(shí)候，我們都會(huì)問(wèn)一個(gè)問(wèn)題，那就是稱重傳感器的靈敏度怎么樣。稱重傳感器的會(huì)有很多功能參數(shù)向我們說(shuō)明這種稱重傳感器的性能，其中有蠕變、溫度漂移、精度、重復(fù)性等等。Z主要的參數(shù)之一-靈敏度，當(dāng)然，它一般是如下標(biāo)注的：靈敏度2±0.002（mv/v）這個(gè)靈敏度是什么意思呢？這是傳器的一個(gè)重要性能指標(biāo)，當(dāng)然其它指標(biāo)也很重要，但在我們選擇傳感器要使用時(shí)，這個(gè)指標(biāo)會(huì)直接影響到使用。其實(shí)它的意思是，傳感器在受到額定的拉力（如果滿量程是200KG的，它的額定拉力就是200KG）做用下，在激勵(lì)電壓（也叫供橋電壓，輸入電壓）是1v的情況下，它的兩個(gè)輸出端會(huì)有2mv的壓力變化。當(dāng)然實(shí)際工作時(shí)激勵(lì)電壓會(huì)大于1v，一般為10v到12v。如果一個(gè)200KG的傳感器，它的靈敏度是2±0.002（mv/v），它的激勵(lì)電壓是10v，那么在200KG拉力作用下，輸出端的壓力變化就是2*10=20mv。我們?cè)谶x擇傳感器的時(shí)候，往往是三個(gè)或四個(gè)同時(shí)并聯(lián)使用的，必須要求每個(gè)傳感器的靈敏度要相同才能同時(shí)使用。如果不相同的會(huì)使整個(gè)秤不準(zhǔn)，把一個(gè)東西放在同一個(gè)秤的不同地方會(huì)顯示不同的重量。如果在更換損壞的傳感器時(shí)，也要找到靈敏度和量程相同的傳感器，其它的指標(biāo)可以忽略，只要這兩項(xiàng)指標(biāo)相同，不考慮穩(wěn)定性、尺寸等前提下，就是不同廠家的傳感器放在一起用也可以。當(dāng)然，如果由配套的就更好了！以上是由實(shí)干小編特別問(wèn)為您分享歡迎您來(lái)電咨詢！我司還有更多驚喜您還會(huì)感興趣的有:電子吊鉤秤，電子地磅稱，鋼瓶秤，地磅秤，數(shù)顯測(cè)力儀，叉車(chē)電子稱等產(chǎn)品哦！詳情請(qǐng)關(guān)注實(shí)干。[詳細(xì)]

  2024-09-21 20:30

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