免疫組化法（IHC）是使用抗體檢測(cè)組織切片（例如肝臟、胰-腺或心臟）中細(xì)胞蛋白質(zhì)（抗原）的過程。

當(dāng)組織樣本被送到實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行疾病檢查時(shí)，有幾個(gè)細(xì)節(jié)不易確定。幾種疾病或疾病亞型在顯微鏡下可能看起來相似或看起來具有相似大小的細(xì)胞，但具有不同的行為和必要的治-療，區(qū)分它們的最佳方法是檢測(cè)這些細(xì)胞上作為標(biāo)記的特定分子。免疫組化法（IHC）是一種使用抗體（匹配分子）的技術(shù)，用于尋找、識(shí)別附著在細(xì)胞上的標(biāo)記物。在顯微鏡下可以看到抗體本身，這有助于技術(shù)人員進(jìn)行精確識(shí)別。

免疫組化法（IHC）已廣泛應(yīng)用于醫(yī)學(xué)中，特別是癌癥診斷。淋巴瘤是依賴于IHC進(jìn)行正確診斷和治-療決策的癌癥之一。

免疫組化常見問題：

問題一：我應(yīng)該使用PIER還是HIER進(jìn)行抗原修復(fù)？

固定過程可能會(huì)掩蓋抗原，導(dǎo)致抗體結(jié)合無法進(jìn)行。這種掩蓋可以通過一種稱為抗原修復(fù)/抗原去掩蔽的技術(shù)來逆轉(zhuǎn)，該技術(shù)可以通過加熱（HIER；熱誘導(dǎo)抗原修復(fù)）或蛋白酶（PIER；蛋白水解誘導(dǎo)抗原修復(fù)）介導(dǎo)。后者使用蛋白酶K、胰蛋白酶和胃蛋白酶等酶。PIER方法通過降解掩蓋表位的肽而起作用。然而，PIER也可能導(dǎo)致樣品形態(tài)或抗原本身的改變。因此，PIER的使用頻率低于HIER，后者通過恢復(fù)表位的二級(jí)和三級(jí)結(jié)構(gòu)而起作用。

為了確定是否應(yīng)該進(jìn)行抗原修復(fù)以及采用哪種方法，應(yīng)遵循以下指南：

進(jìn)行文獻(xiàn)檢索，以確定其他研究人員如何可視化您感興趣的抗原。

檢查抗體供應(yīng)商是否推薦了特定的抗原修復(fù)-方案。

如果沒有特定的協(xié)議可用，我們建議使用HIER而不是PIER協(xié)議。

對(duì)于HIER，總是使用中性抗原修復(fù)緩沖液，并與未進(jìn)行抗原修復(fù)的樣品進(jìn)行比較。

如果中性染色溶液沒有產(chǎn)生良好的染色效果，則應(yīng)測(cè)試堿性或酸性抗原修復(fù)緩沖液。除了pH值外，其他需要優(yōu)化的參數(shù)是溫度和持續(xù)時(shí)間。理想情況下，嘗試各種pH值、溫度和時(shí)間組合。

為了排除由HIER過程引起的偽影，始終包括一個(gè)控制樣品，該樣品在沒有HIER步驟的情況下進(jìn)行染色。

問題二：如何選擇IHC實(shí)驗(yàn)的抗體，單克隆抗體還是多克隆抗體？

單克隆抗體和多克隆抗體的抗體特性決定了其優(yōu)缺點(diǎn)。單克隆抗體是針對(duì)單個(gè)表位的同種免疫球蛋白。抗體是由一個(gè)動(dòng)物的單個(gè)B細(xì)胞克隆產(chǎn)生的，因此在免疫化學(xué)上相似。多克隆抗體是針對(duì)同一抗原的各種表位的異質(zhì)抗體混合物。抗體是由動(dòng)物的不同B細(xì)胞克隆產(chǎn)生的，因此在免疫化學(xué)上不同。多克隆混合物中的抗體可能具有略微不同的特異性和親和力。

如果蛋白質(zhì)靶標(biāo)具有相同的氨基酸序列，單克隆抗體更合適。一旦抗原因各種原因發(fā)生構(gòu)象變化，如蛋白質(zhì)相互作用、翻譯后修飾、溫度、pH值、固定、鹽濃度等，單克隆抗體和抗原的聯(lián)合作用將受到嚴(yán)重影響。由于多克隆抗體具有多個(gè)表位，不受蛋白質(zhì)構(gòu)象變化的影響，一般來說，在一定范圍內(nèi)的pH和鹽濃度內(nèi)，多克隆抗體之間的抗原結(jié)合比單克隆抗體更穩(wěn)定。

問題三：一抗的孵育時(shí)間多久？

一抗的孵育時(shí)間與溫度,抗體濃度有關(guān)。一般情況下,在37℃的條件下,孵育1-2小時(shí)左右。在室溫的條件下,孵育3小時(shí)左右。在4℃的條件下,孵育18-24小時(shí)左右。

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