海能技術(shù)

實(shí)驗(yàn)方案

讓每次分享都產(chǎn)生價(jià)值

前言

疫苗，大家都很熟悉，但其中所含的成分或許少有人知。

佐劑是疫苗的增強(qiáng)劑，當(dāng)它先于抗原或與抗原混合注入機(jī)體后，能夠增強(qiáng)機(jī)體對(duì)抗原的免疫應(yīng)答或者改變免疫反應(yīng)的類(lèi)型，屬于非特異性的免疫增強(qiáng)劑。

佐劑的質(zhì)量也影響到疫苗的整體質(zhì)量，測(cè)定羥值、碘值、過(guò)氧化值等，可以作為判斷疫苗的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。

檢測(cè)方法與儀器

使用T960全自動(dòng)滴定儀，運(yùn)用電位滴定檢測(cè)方法檢測(cè)方便，可減少人為判斷指示劑顏色對(duì)結(jié)果的誤差影響，增加檢測(cè)精確度，提高檢測(cè)效率，解放操作員的雙手。

實(shí)驗(yàn)示例

本實(shí)驗(yàn)主要示例電位滴定法測(cè)定疫苗佐劑中的碘值。

儀器與試劑

儀器

T960 全自動(dòng)電位滴定儀、鉑復(fù)合電極、分析天平等。

試劑

三 氯甲烷、韋氏試劑、碘化鉀、硫代硫酸鈉標(biāo)準(zhǔn)滴定液（0.1mol/L）。

實(shí)驗(yàn)方法

樣品檢測(cè)

準(zhǔn)確稱取 1.0g 樣品，置于滴定杯中，加入三 氯甲烷30mL溶解，攪拌均勻，向滴定杯中準(zhǔn)確加入10mL韋氏試劑，封口膜密封，暗處放置1 小時(shí)，然后加入15mL碘化鉀和10mL水，在合適的攪拌速度下，插入電極和滴定頭，設(shè)置好參數(shù)，用硫代硫酸鈉標(biāo)準(zhǔn)滴定液（0.1mol/L），以鉑復(fù)合電極為工作電極，在T960上進(jìn)行滴定至終點(diǎn)。同時(shí)做空白實(shí)驗(yàn)。

設(shè)定滴定儀參數(shù)為:

滴定模式：動(dòng)態(tài)滴定，最小添加體積：0.02mL，電極平衡時(shí)間：4s，預(yù)添加體積：25mL，電極平衡電位：1mv，滴定速度：標(biāo)準(zhǔn)，結(jié)束體積：50mL，相關(guān)系數(shù)：-12.69，電位突躍量：200，補(bǔ)液速度：5，攪拌速度：10，滴定前平衡電位：10mv。

測(cè)試圖譜示例：

結(jié)果與討論

實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖所示：

結(jié)論

本次測(cè)試的的動(dòng)物疫苗佐劑均滿足測(cè)試結(jié)果在4.0-9.0 范圍內(nèi)，能夠滿足動(dòng)物疫苗佐劑的質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)，并且操作簡(jiǎn)單，檢測(cè)效率高，能夠滿足實(shí)驗(yàn)室日常檢測(cè)需求。

小提示

這些增強(qiáng)劑是藥物制劑當(dāng)中經(jīng)常會(huì)包含的常規(guī)成分，臨床上并沒(méi)有毒，而且含量也比較少，不用擔(dān)心對(duì)身體的影響。

在疫情仍未停歇的當(dāng)下，做好個(gè)人防護(hù)對(duì)每個(gè)人來(lái)說(shuō)既是簡(jiǎn)單的，又是必要的。而群體防護(hù)的順利實(shí)施，則要?dú)w功于抵抗新冠的各類(lèi)疫苗了。這其中，就有免疫效果不錯(cuò)的mRNA疫苗。mRNA疫苗具有廣泛的應(yīng)用領(lǐng)域和顯著的治療優(yōu)勢(shì)，因而成為諸多藥企競(jìng)相追逐的熱點(diǎn)。本期，小編就帶大家了解一下mRNA疫苗開(kāi)發(fā)的工藝流程。

01 DNA原液供應(yīng)

質(zhì)粒 DNA (pDNA) 是mRNA疫苗生產(chǎn)不可或缺的原材料，可用作 mRNA 的模板。在制備時(shí)，第一步是要提取病毒刺突蛋白的DNA序列，然后構(gòu)建帶有該序列的DNA質(zhì)粒，接著經(jīng)過(guò)擴(kuò)增、純化、質(zhì)檢等諸多過(guò)程形成我們最終所需的DNA原液。

在mRNA疫苗開(kāi)發(fā)應(yīng)用方面，質(zhì)粒生產(chǎn)也面臨著諸多的壓力，尤其是 GMP的壓力。

02 mRNA原液制備 體外轉(zhuǎn)錄（IVT）是mRNA原液制備的主要手段。pDNA 可作為IVT的模板，合成所需的 mRNA 分子。 IVT的工藝比較復(fù)雜，除使用pDNA外，還需要添加合成mRNA的必要成分，如核苷酸和mRNA聚合酶。為提高mRNA穩(wěn)定性，降低其免疫原性，還需在 mRNA的5'末端添加加帽試劑。除此之外，合理設(shè)計(jì)5'或3'非翻譯區(qū)(UTR)也可以調(diào)整mRNA的穩(wěn)定性及蛋白質(zhì)的翻譯效率。 mRNA的純度影響著翻譯后蛋白的效力，因此，mRNA原液制備后的純化過(guò)程也是必不可少的，可采用TFF（切向流過(guò)濾）或SEC（尺寸排阻色譜）等方法來(lái)去除少量殘留雜質(zhì)。

03 mRNA包封 為防止疫苗有效成分mRNA進(jìn)入細(xì)胞前被降解，可采用脂質(zhì)納米顆粒(LNP)對(duì)其進(jìn)行包裹。具體過(guò)程為：將各種脂質(zhì)成分按一定的比例進(jìn)行混合，溶解在乙醇或其他有機(jī)溶劑中；將mRNA溶解于水中，并用酸性緩沖液稀釋至合適濃度。配置好的兩相溶液在微流控設(shè)備上進(jìn)行均勻混合，快速制備包裹mRNA的核酸脂質(zhì)納米顆粒。與微流控設(shè)備匹配的核心耗材為微流控芯片，圖1即為芯片內(nèi)部通道示意圖。 

圖1.微流控芯片通道示意圖

04 后處理 mRNA包封后需要進(jìn)一步的純化?？赏ㄟ^(guò)超濾去除有機(jī)相以及未包封的游離成分。超濾過(guò)程中可以進(jìn)行溶劑緩沖體系的置換，以及PH值的調(diào)節(jié)，最終復(fù)合物的濃度根據(jù)需求進(jìn)行靈活控制。 

圖2.超濾管

 至于細(xì)菌、微生物的清除，一般采用0.22μm的除菌級(jí)過(guò)濾器即可。 純化后的mRNA-LNP溶液還可以添加必要的輔料成分，以提升產(chǎn)品長(zhǎng)期保存的穩(wěn)定性。

05 儲(chǔ)存運(yùn)輸 mRNA疫苗布局開(kāi)發(fā)過(guò)快也帶來(lái)了些不可避免的問(wèn)題，即需要低溫來(lái)保持疫苗穩(wěn)定，這大大的提升了對(duì)儲(chǔ)存和運(yùn)輸?shù)囊?。在?chǔ)存運(yùn)輸過(guò)程中需進(jìn)行持續(xù)的溫度監(jiān)測(cè)，以確保產(chǎn)品始終處于規(guī)定的溫度范圍，否則很難保證最終患者給藥時(shí)產(chǎn)品的安全性和有效性。 總結(jié)：mRNA疫苗有著廣闊的應(yīng)用前景，其開(kāi)發(fā)過(guò)程也必然充滿挑戰(zhàn)。了解開(kāi)發(fā)的各個(gè)工藝流程，方能鎖定難點(diǎn)，各個(gè)擊破，向疫苗的成功開(kāi)發(fā)更進(jìn)一步。  

納米藥物制備系統(tǒng)

應(yīng)用范圍：

● 核酸藥物發(fā)展的前沿方向

● mRNA疫苗的開(kāi)發(fā)與挑戰(zhàn)

● 核酸脂質(zhì)納米?？破铡獪\談儀器參數(shù)對(duì)結(jié)果的影響

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