多糖-蛋白結(jié)合疫苗
結(jié)合疫苗是指采用化學(xué)方法將多糖共價(jià)結(jié)合在蛋白載體上所制備成的多糖--蛋白結(jié)合疫苗。因僅靠多糖抗原不足以提供可靠的保護(hù)，多糖僅可誘導(dǎo)B細(xì)胞免疫，產(chǎn)生的抗體活性弱，且無法形成免疫記憶，多糖疫苗對嬰幼兒無免疫效果。而多糖結(jié)合載體蛋白，免疫反應(yīng)性質(zhì)發(fā)生轉(zhuǎn)變，可以增強(qiáng)免疫原性。如 B型嗜血桿菌（Hib）結(jié)合疫苗、腦膜炎球菌結(jié)合疫苗和肺炎球菌結(jié)合疫苗等，可有效誘導(dǎo)嬰幼兒免疫。

那么，為什么多糖與載體蛋白一定要共價(jià)結(jié)合嗎，如果是松散結(jié)合，位于同一濾泡樹突狀細(xì)胞（FDC）中，難道就不能誘導(dǎo)濾泡輔助T細(xì)胞（Tfh）反應(yīng)嗎？

答案是不能。原因?yàn)楫?dāng)多糖與載體蛋白松散結(jié)合時(shí)，在FDC提呈過程中，蛋白質(zhì)和多糖無法同時(shí)被多糖特異性B細(xì)胞（BCR）結(jié)合，導(dǎo)致蛋白質(zhì)留存在FDC中，多糖被B細(xì)胞內(nèi)化，同樣無法被主要組織相容性復(fù)合物（MHC II）提呈于B細(xì)胞表面，多糖抗原依舊停留在B細(xì)胞內(nèi)化階段。

圖源：《Understanding Modern Vaccines:Perspectives in Vaccinology》

更好地實(shí)現(xiàn)共價(jià)結(jié)合

多糖-蛋白質(zhì)共價(jià)結(jié)合物的形成是基于蛋白質(zhì)分子中的氨基酸側(cè)鏈的自由氨基和多糖分子還原末端的羥基之間的羥氨反應(yīng)，即Maillard反應(yīng)。蛋白質(zhì)分子在水溶液中趨于形成各種高級(jí)結(jié)構(gòu)，一些反應(yīng)基團(tuán)被包埋于結(jié)果內(nèi)部。而多糖由于立體效應(yīng)，具體強(qiáng)烈的取向性。因此，蛋白質(zhì)和多糖的反應(yīng)條件較為嚴(yán)苛。

反應(yīng)必須在低于蛋白質(zhì)變性的溫度條件下進(jìn)行的，而且反應(yīng)時(shí)還需控制反應(yīng)體系中的較低水分活度使得蛋白質(zhì)中的氨基處于非聚集的反應(yīng)狀態(tài)。此條件下，Maillard反應(yīng)速度很慢，通常需要2-3天，甚至更長。

通常操作步驟：

多糖預(yù)處理：降低分子量，降低粘度

將多糖溶解在選定的pH緩沖溶液中

攪拌均勻后進(jìn)行冷凍干燥

加入蛋白質(zhì)，在合適的溫度（如37°C）進(jìn)行長時(shí)間反應(yīng)

來自 IKA 的理想答卷

有沒有這樣一款設(shè)備，既能在反應(yīng)過程中監(jiān)控粘度的變化，又能測pH，還能實(shí)現(xiàn)溫控和長時(shí)間的攪拌呢?!

理想答卷

IKA EasySyn 化學(xué)合成釜化學(xué)合成釜搭配 Starvisc 攪拌扭矩測量儀，實(shí)時(shí)顯示扭矩（對應(yīng)粘度），用扭矩值精確控制，消除批次間的差異

Starvisc 攪拌扭矩測量儀，適合2-3天甚至是更長時(shí)間的連續(xù)、穩(wěn)定工作

7口釜蓋可同時(shí)集成：攪拌，溫度和pH。攪拌槳，溫度和pH均為PTFE材質(zhì)，耐化學(xué)腐蝕。

釜體密封性好，極限真空可達(dá)3mbar，可在釜體中實(shí)現(xiàn)真空干燥，同時(shí)隔絕污染。

操作安全：溫控管固定在支架上，由排氣排液閥再外接控溫，減少對夾套接頭的應(yīng)力。玻璃釜體和攪拌頭調(diào)節(jié)下降終點(diǎn)有限位，即便調(diào)節(jié)高度時(shí)沒拿穩(wěn)，釜體也不會(huì)碰到桌面，使用更安心。

當(dāng)然，為避免操作過程中帶來不必要的污染，加料可以通過蠕動(dòng)泵來實(shí)現(xiàn)，直接連接到釜蓋上即可。我們還可以通過軟件實(shí)現(xiàn)條件式控制，譬如溫度和pH達(dá)到預(yù)設(shè)值后，啟動(dòng)蠕動(dòng)泵加料，啟動(dòng)攪拌等。實(shí)驗(yàn)方法和數(shù)據(jù)都可以完整記錄，分3級(jí)管理，完全符合國家食藥局的“藥品記錄和數(shù)據(jù)管理要求”。

免費(fèi)試 用

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疫苗

Vaccine

疫苗有過負(fù) 面報(bào)道，但是國產(chǎn)新冠疫苗遠(yuǎn)銷海內(nèi)外，三年疫苗接種老少男女上億人次，事實(shí)證明，國產(chǎn)疫苗能浴火重生、安全可靠。

1、如何確保防疫針劑有效和安全？

藥理有效性需要通過液相質(zhì)譜儀等儀器查驗(yàn)。

2、如何確保疫苗針劑的西林瓶密封無破損？

在歐洲、美國和印度制藥廠都采用雙光源X射線檢測，特別是凍干粉針劑無法通過燈檢來檢出西林瓶中的碎玻璃。

Thermo Scientific? Xpert? 側(cè)射型 X 射線檢查系統(tǒng)

3、如何保證注射的劑量是安全和有效呢？

 為什么有的孩子注射后會(huì)有不良反應(yīng)？

 是否超過安全劑量？

生產(chǎn)疫苗制劑已經(jīng)采用全自動(dòng)生產(chǎn)流水線，凍干粉和水針劑都采用自動(dòng)灌裝，灌裝后的劑量檢測是采用動(dòng)態(tài)檢重秤設(shè)備，一般疫苗要求控制重量誤差為10至30毫克；而傳統(tǒng)檢重秤稱量臺(tái)帶有電機(jī)、軸承和滾軸會(huì)產(chǎn)生振動(dòng)影響稱量，無法保證一年后動(dòng)態(tài)稱量精度達(dá)到10-30毫克，如同汽車開了一年需要保養(yǎng)才能上路，五年后的保養(yǎng)成本會(huì)越來越高，而且不能達(dá)到新車狀態(tài)。

核心技術(shù)

Core technology

賽默飛世爾科技公司成功突破了高速和高精度的瓶頸，其核心采用松帶專 利技術(shù)：稱重傳感器采用工業(yè)級(jí)、動(dòng)態(tài)響應(yīng)迅速的應(yīng)變電阻稱重傳感器。Thermo Scientific Versa Rx選用的是針對動(dòng)態(tài)檢重秤應(yīng)用的應(yīng)變電阻稱重傳感器，其松帶技術(shù)使稱量臺(tái)上沒有電機(jī)。首先，徹底消除電機(jī)振動(dòng)，其次實(shí)現(xiàn)了稱量臺(tái)自重輕巧，可以忽略稱量臺(tái)本身重量，只考慮最 大產(chǎn)品重量，相對而言稱量臺(tái)的有效稱量精度提高到0.01%。換而言之，達(dá)到與電磁補(bǔ)償式稱重傳感器一樣的稱量精度，實(shí)現(xiàn)了高速高精度的夢想，在600件/分鐘時(shí)，根據(jù)包裝袋的大小不同，最 佳動(dòng)態(tài)精度可達(dá)到10-30mg。

應(yīng)用要點(diǎn)

Application key points

在醫(yī)藥行業(yè)采用檢重秤（或稱為：分選秤）主要用于檢測說明書缺損和確保灌裝量。要求測量速度高：一般在300件/分鐘以上；動(dòng)態(tài)檢測精度高：一般要求正負(fù)偏差在100mg至300mg。

影響檢重秤動(dòng)態(tài)精度的因素除了機(jī)器本身的機(jī)械振動(dòng)影響以外，產(chǎn)品長度、產(chǎn)品內(nèi)部晃動(dòng)以及環(huán)境因素都會(huì)影響精度。在相同稱量臺(tái)長度條件下產(chǎn)品長度越長，稱量時(shí)間越短精度會(huì)越差，克服方法是加長稱量段長度。

01、消除不利檢重秤的環(huán)境因素

基礎(chǔ)不堅(jiān)固，基礎(chǔ)振動(dòng)，檢重秤支撐腳懸空，檢重秤輸入端與前端輸送機(jī)之間的空隙過大，運(yùn)行時(shí)輸入/輸出皮帶碰到秤量段和各種方向的氣流影響都會(huì)影響檢重秤的動(dòng)態(tài)稱量。氣流影響可以通過增加防風(fēng)罩解決。中包裝段所處位置經(jīng)常有叉車或液壓車裝卸貨物，因此基礎(chǔ)振動(dòng)對檢重秤影響較大。

02、克服基礎(chǔ)振動(dòng)

Thermo Scientific的Versa Rx檢重秤應(yīng)用了DBSVAC(Dynamic broad spectrum vibration analysis and compensation) 動(dòng)態(tài)寬頻振動(dòng)分析和補(bǔ)償專 利技術(shù)，通過分析和補(bǔ)償基礎(chǔ)振動(dòng)消除了基礎(chǔ)振動(dòng)對檢重秤影響。

03、消除產(chǎn)品內(nèi)部晃動(dòng)

液體藥品內(nèi)部的藥水晃動(dòng)可以影響檢重秤動(dòng)態(tài)精度，Thermo Scientific的VersaRx檢重秤從輸入段到稱量段到輸出段采用刀口設(shè)計(jì)，使液體藥品非常平滑進(jìn)入稱量臺(tái)，從而克服了藥水晃動(dòng)的稱量的影響。

在疫情仍未停歇的當(dāng)下，做好個(gè)人防護(hù)對每個(gè)人來說既是簡單的，又是必要的。而群體防護(hù)的順利實(shí)施，則要?dú)w功于抵抗新冠的各類疫苗了。這其中，就有免疫效果不錯(cuò)的mRNA疫苗。mRNA疫苗具有廣泛的應(yīng)用領(lǐng)域和顯著的治療優(yōu)勢，因而成為諸多藥企競相追逐的熱點(diǎn)。本期，小編就帶大家了解一下mRNA疫苗開發(fā)的工藝流程。

01 DNA原液供應(yīng)

質(zhì)粒 DNA (pDNA) 是mRNA疫苗生產(chǎn)不可或缺的原材料，可用作 mRNA 的模板。在制備時(shí)，第一步是要提取病毒刺突蛋白的DNA序列，然后構(gòu)建帶有該序列的DNA質(zhì)粒，接著經(jīng)過擴(kuò)增、純化、質(zhì)檢等諸多過程形成我們最終所需的DNA原液。

在mRNA疫苗開發(fā)應(yīng)用方面，質(zhì)粒生產(chǎn)也面臨著諸多的壓力，尤其是 GMP的壓力。

02 mRNA原液制備 體外轉(zhuǎn)錄（IVT）是mRNA原液制備的主要手段。pDNA 可作為IVT的模板，合成所需的 mRNA 分子。 IVT的工藝比較復(fù)雜，除使用pDNA外，還需要添加合成mRNA的必要成分，如核苷酸和mRNA聚合酶。為提高mRNA穩(wěn)定性，降低其免疫原性，還需在 mRNA的5'末端添加加帽試劑。除此之外，合理設(shè)計(jì)5'或3'非翻譯區(qū)(UTR)也可以調(diào)整mRNA的穩(wěn)定性及蛋白質(zhì)的翻譯效率。 mRNA的純度影響著翻譯后蛋白的效力，因此，mRNA原液制備后的純化過程也是必不可少的，可采用TFF（切向流過濾）或SEC（尺寸排阻色譜）等方法來去除少量殘留雜質(zhì)。

03 mRNA包封 為防止疫苗有效成分mRNA進(jìn)入細(xì)胞前被降解，可采用脂質(zhì)納米顆粒(LNP)對其進(jìn)行包裹。具體過程為：將各種脂質(zhì)成分按一定的比例進(jìn)行混合，溶解在乙醇或其他有機(jī)溶劑中；將mRNA溶解于水中，并用酸性緩沖液稀釋至合適濃度。配置好的兩相溶液在微流控設(shè)備上進(jìn)行均勻混合，快速制備包裹mRNA的核酸脂質(zhì)納米顆粒。與微流控設(shè)備匹配的核心耗材為微流控芯片，圖1即為芯片內(nèi)部通道示意圖。 

圖1.微流控芯片通道示意圖

04 后處理 mRNA包封后需要進(jìn)一步的純化。可通過超濾去除有機(jī)相以及未包封的游離成分。超濾過程中可以進(jìn)行溶劑緩沖體系的置換，以及PH值的調(diào)節(jié)，最終復(fù)合物的濃度根據(jù)需求進(jìn)行靈活控制。 

圖2.超濾管

 至于細(xì)菌、微生物的清除，一般采用0.22μm的除菌級(jí)過濾器即可。 純化后的mRNA-LNP溶液還可以添加必要的輔料成分，以提升產(chǎn)品長期保存的穩(wěn)定性。

05 儲(chǔ)存運(yùn)輸 mRNA疫苗布局開發(fā)過快也帶來了些不可避免的問題，即需要低溫來保持疫苗穩(wěn)定，這大大的提升了對儲(chǔ)存和運(yùn)輸?shù)囊?。在?chǔ)存運(yùn)輸過程中需進(jìn)行持續(xù)的溫度監(jiān)測，以確保產(chǎn)品始終處于規(guī)定的溫度范圍，否則很難保證最終患者給藥時(shí)產(chǎn)品的安全性和有效性。 總結(jié)：mRNA疫苗有著廣闊的應(yīng)用前景，其開發(fā)過程也必然充滿挑戰(zhàn)。了解開發(fā)的各個(gè)工藝流程，方能鎖定難點(diǎn)，各個(gè)擊破，向疫苗的成功開發(fā)更進(jìn)一步。  

納米藥物制備系統(tǒng)

應(yīng)用范圍：

● 核酸藥物發(fā)展的前沿方向

● mRNA疫苗的開發(fā)與挑戰(zhàn)

● 核酸脂質(zhì)納米?？破铡獪\談儀器參數(shù)對結(jié)果的影響

● 核酸脂質(zhì)納米粒科普——超濾管規(guī)格

● 核酸脂質(zhì)納米?？破铡筇幚?/p>

 
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腫瘤疫苗背景

腫瘤疫苗，是一種具有預(yù)防和治 療潛力的有吸引力的替代免疫治 療選擇，是近年研究的熱點(diǎn)之一。針對腫瘤相關(guān)抗原（Tumor-associated antigen,TAA）或腫瘤特異性抗原 (Tumor specific antigen,TSA) 的疫苗可以特異性地攻擊和破壞抗原過表達(dá)的惡性細(xì)胞，并由于免疫記憶而實(shí)現(xiàn)慢性治 療反應(yīng)。因此，與其他免疫療法相比，癌癥疫苗提供了特異性、安全性和可耐受的治 療。

根據(jù)腫瘤抗原的組分，癌癥疫苗大致可以分為四種類型：基于 DNA 的疫苗，基于 RNA 的疫苗，基于多肽的疫苗和基于免疫細(xì)胞的疫苗。FDA 批準(zhǔn)的首 個(gè)個(gè)性化腫瘤疫苗 PROVENGE (Sipuleucel-T) 是一種基于免疫細(xì)胞的疫苗，用于激素難治性前列腺癌的治 療。除此之外，Moderna，BioNTech 都在布局基于 mRNA 的腫瘤疫苗。

圖 1 腫瘤疫苗抗原呈遞平臺(tái)示意圖

腫瘤疫苗有效性評(píng)估方法

生物體接種疫苗后，腫瘤抗原被帶到淋巴結(jié)，進(jìn)而激活抗原特異性的 B 細(xì)胞和 T 細(xì)胞，活化的 B 細(xì)胞產(chǎn)生的抗體及活化的效應(yīng) T 細(xì)胞會(huì)使腫瘤內(nèi)脹并誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞死亡。

圖 2 腫瘤疫苗誘導(dǎo)的免疫反應(yīng)示意圖

如何有效的評(píng)估腫瘤疫苗的有效性是一個(gè)非常值得探討的問題，常用的腫瘤疫苗有效性驗(yàn)證的方法，包括細(xì)胞因子檢測、CTL 活性檢測、T 細(xì)胞活化標(biāo)志物檢測、抗體滴度檢測、ADCC 檢測等。

1、細(xì)胞因子檢測

細(xì)胞因子是由免疫細(xì)胞經(jīng)過刺激而合成并分泌的小分子蛋白質(zhì)，在免疫應(yīng)答中起著非常重要的作用，因此可以通過細(xì)胞因子的分泌能力來反應(yīng)疫苗誘導(dǎo)的細(xì)胞免疫的水平。常見的細(xì)胞因子有白介素 (IL) 、干擾素 (IFN)、 腫瘤壞死因子 (TNF) 等。下面比較了幾種常見的檢測方法。

ELISA 是一種非常經(jīng)典的細(xì)胞因子的檢測方法，例如在王曉東等人發(fā)表的關(guān)于胃癌疫苗研究的文章中，提到了用 ELISA 的方法檢測接種疫苗后小鼠骨 髓源樹突狀細(xì)胞（BMDCs）分泌細(xì)胞因子的能力，檢測方法如下：

BMDCs 在含有 10ng/mL GM-CSF 和 10ng/mL IL-4 的 X-vivo 15 培養(yǎng)基中培養(yǎng)，37℃下培養(yǎng) 6 天，然后以每孔 5×104 細(xì)胞的密度在 96 孔板中接種。以 5μM 或 10μM 的最 終濃度加入疫苗抗原，孵育 24 小時(shí)。使用小鼠 TNF-α 和 IL-12 p70 ELISA Ready-SET-Go 試劑組定量培養(yǎng)上清中的 TNF-α 和 IL-12 。首先在 4℃下用捕獲抗體包被 ELISA 板過夜，然后在室溫下依次加入阻斷液、細(xì)胞培養(yǎng)上清和檢測抗體，孵育 1h 。 最 后加入終止液和顯色劑，用酶標(biāo)儀 (BioTek) 在 450nm 處記錄 OD 值。

檢測結(jié)果如下：

從檢測結(jié)果可以看出，T7（TLR7 激動(dòng)劑）的存在可以顯著提升 ML/MB 抗原誘導(dǎo)的免疫反應(yīng)。

圖 3 ELISA 法測定小鼠骨 髓樹突狀細(xì)胞 (BMDCs) 分泌

TNF-α (a) 和 IL-12 (b) 的水平

Ankita Leekha 等人發(fā)表的關(guān)于 SRAS-COV2 疫苗文章中，提到了用 ELISPOT 的方法評(píng)估細(xì)胞因子的分泌水平，可以作為參考。具體方法如下：

從小鼠中分離脾細(xì)胞和肺細(xì)胞，使用小鼠 IFNγ ELISpot 基礎(chǔ)試劑盒和小鼠 IL4 ELISpot 基礎(chǔ)試劑盒 (Mabtech, VA, USA) 進(jìn)行 IFNγ 和 IL4 ELISpot 檢測。在 37℃ 下，在預(yù)包被抗體的 ELISpot 板中，用抗原刺激脾細(xì)胞和肺細(xì)胞，培養(yǎng) 16-18 小時(shí)。第二天，洗掉細(xì)胞，加入生物素化的檢測抗體。洗板后，加入 1:30000 稀釋的 Extravidi-ALP 偶聯(lián)物，室溫孵育 1 小時(shí)。洗板后，每孔添加 70μL 顯色液，孵育 20-30min，形成斑點(diǎn)，然后用水清洗，干燥。使用 Cytation 7 (BioTek) 對斑點(diǎn)進(jìn)行量化。每個(gè)點(diǎn)對應(yīng)一個(gè)單獨(dú)的細(xì)胞因子分泌細(xì)胞。

檢測結(jié)果如下：

圖 4 ELIPSOT 方法檢測小鼠脾細(xì)胞

和肺細(xì)胞分泌細(xì)胞因子的水平

2、CTL 活性檢測

疫苗誘導(dǎo)的細(xì)胞毒性 T 淋巴細(xì)胞 (CTL) 可以直接殺傷腫瘤細(xì)胞，起到抗腫瘤的作用，因此可以通過檢測 CTL 的殺傷效應(yīng)來反應(yīng)疫苗的效果。常用的檢測細(xì)殺傷效應(yīng)的方法有很多，下表列舉了一些常用的方法。

王曉東等人發(fā)表的文章中提到了 LDH 檢測，檢測方法如下：

從接種疫苗小鼠的脾 臟中分離淋巴細(xì)胞（效應(yīng)細(xì)胞）。EAC 腫瘤細(xì)胞（靶細(xì)胞）與淋巴細(xì)胞（效應(yīng)細(xì)胞-靶細(xì)胞比例為 50:1）共培養(yǎng) 4h，使用乳酸脫氫 (LDH) 法測定細(xì)胞毒性。將培養(yǎng) 4h 后的培養(yǎng)上清加入在 ELISA 板中，室溫下加入底物溶液，孵育 30min。最 后，加入終止液終止反應(yīng)，并用酶標(biāo)儀 (BioTek) 在 490nm 處檢測光密度。

檢測結(jié)果如下：

相對于 PBS 對照組來說，T7-MB 組 CTL 細(xì)胞具有顯著的殺傷效應(yīng)。

圖 5 LDH 法測定 CTL 介導(dǎo)的 EAC 靶細(xì)胞的裂解水平

3、抗體滴度及親和力檢測

腫瘤疫苗除了可以誘導(dǎo)細(xì)胞免疫之外，也可誘導(dǎo)體液免疫，對此可通過對抗體滴度及親和力進(jìn)行檢測來反應(yīng)疫苗抗腫瘤的效果，ELISA 是一種非常經(jīng)典的檢測方法。

上述關(guān)于胃癌疫苗的文章中通過 ELISA 方法測定小鼠接種疫苗后血清中總 IgG 含量，具體檢測過程如下：

小鼠接種疫苗后收集血液樣本，通過 3000g 離心 15 分鐘獲得血清樣本。ELISA 板預(yù)先在 4℃ 包被 BSA-MG1 過夜，然后在室溫下依次加載封閉溶液 2h，血清樣品 (1:50 稀釋) 和檢測抗體 1h。最 后，在體系中加入 p-NPP 底物 (Millipore) 和終止液，用酶標(biāo)儀 (BioTek) 在 405nm 處記錄 OD 值。

檢測結(jié)果如下：

相對于 PBS 對照組來說，T7-MB 組抗體含量明顯上升。

圖6 ELISA法測定疫苗誘導(dǎo)的血清抗體水平

除此之外，在 Emily C. Gale 等人發(fā)表的關(guān)于 mRNA 遞送系統(tǒng)及輔劑研究的文章中，通過 ELISA 的方法測定了 mRNA OVA 模式疫苗誘導(dǎo)的 OVA 特異性抗體的絕 對含量及其親和力。具體檢測方法如下：

抗體濃度：小鼠接種加強(qiáng)疫苗后，采集血液樣品，血清按照 1:100 000 進(jìn)行稀釋。采用 anti-OVA mouse IgG1 ELISA (Cayman Chemicals) 試劑，按照試劑廠家的說明進(jìn)行 ELISA 實(shí)驗(yàn)。使用 Synergy H1 Microplate Reader (BioTek) 在 450nm 處記錄 OD 值。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算血清抗體濃度，表示 mg/mL。

抗體親和性：將 12 個(gè)梯度稀釋的血清與恒定濃度標(biāo)記 HRP 的 anti-OVA 抗體 (3nM) 混合，并在 OVA 抗原包被的板中室溫孵育 2 小時(shí)，洗板后用 TMB 底物孵育，用 HCl 停止反應(yīng)。測定 450nm 處的 OD 值。根據(jù)業(yè)內(nèi)發(fā)現(xiàn)的單克隆抗體的共同親和力，假設(shè)對照抗體的 KD 為 1nM 對實(shí)驗(yàn)組的 KD 值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。這一假設(shè)僅影響報(bào)告的絕 對 KD 值，而不影響實(shí)驗(yàn)組之間的相對差異。

檢測結(jié)果如下：

pIC 為雙鏈 RNA 結(jié)構(gòu)模擬物，圖E中比較了可溶性的 pIC 和不同納米顆粒遞送系統(tǒng)誘導(dǎo)的絕 對抗體含量，從圖 E 中可以看出 2B 遞送系統(tǒng)誘導(dǎo)的 OVA 特異性抗體含量最 高。從F和G可以看出 2B 遞送系統(tǒng)相對于可溶性 pIC 來說誘導(dǎo)的 IgG 親和力也顯著升高。

圖 7 pIC/PBAE NPs 增強(qiáng)體液免疫

4、ADCC 檢測

疫苗誘導(dǎo)體液免疫產(chǎn)生的抗體能夠捕捉目標(biāo)抗原，阻斷這個(gè)靶分子的功能，也可以引導(dǎo)其他免疫細(xì)胞（如巨噬細(xì)胞和自然殺傷細(xì)胞）殺死表達(dá)抗原的靶細(xì)胞，在腫瘤治 療中，特別是血液腫瘤中，抗體依賴的細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性作用 (ADCC) 起著關(guān)鍵作用，ADCC 常用的檢測方法包括細(xì)胞活力檢測、LDH 檢測、工程細(xì)胞株、Delfia、RTCA、細(xì)胞成像檢測等。

王曉東等人發(fā)表的關(guān)于胃癌疫苗研究的文章中，提到了 LDH 方法檢測 ADCC，檢測方法如下：

小鼠接種疫苗后，采集其血清樣本（1:25 稀釋），然后與 EAC 細(xì)胞（靶細(xì)胞）在 37°C 孵育 30min。使用小鼠 NK 細(xì)胞分離試劑盒從正常 BALB/c 小鼠中分離出自然殺傷 (NK) 細(xì)胞（效應(yīng)細(xì)胞），與抗體標(biāo)記的 EAC 細(xì)胞以效靶比 50:1 共培養(yǎng) 4 小時(shí)。采用 LDH 法 (Promega) 測定細(xì)胞毒性，檢測方法與之前提到的 CTL 活性檢測的方法一致。

檢測結(jié)果如下：

相對于 PBS 對照組來說，T7-MB 組產(chǎn)生的抗體具有顯著的殺傷效應(yīng)。

圖 8 LDH 法測定血清抗體介導(dǎo)的 EAC 靶細(xì)胞的裂解水平

腫瘤疫苗生物學(xué)活性檢測解決方案推薦

本文介紹了腫瘤疫苗活性檢測的常用方法，包括細(xì)胞因子檢測、CTL 活性檢測、抗體滴度及親和力檢測、ADCC 檢測等方法，涉及到了酶標(biāo)儀、成像系統(tǒng)、流式、RTCA、洗板分液系統(tǒng)等設(shè)備。Agilent 細(xì)胞分析事業(yè)部可以從多個(gè)角度為用戶提供從樣品處理，到結(jié)果檢測再到數(shù)據(jù)分析的全面解決方案。

疫苗檢測：

人生就像一段旅程，這段路程有時(shí)精彩， 有時(shí)荊棘，我們在精彩中綻放自我，在荊棘中奮勇前進(jìn)。而在這段旅程中，保駕護(hù)航的疫苗不僅在傳染病領(lǐng)域提供了預(yù)防功能，新型疫苗在一些醫(yī)學(xué)疑難雜癥的預(yù)防和治 療領(lǐng)域有了新的突破。疫苗因其組成復(fù)雜，結(jié)構(gòu)龐大，工藝繁瑣，使得其檢測和分析更有挑戰(zhàn)。今天我們從疫苗中主成分檢測，工藝監(jiān)控和載體檢測三個(gè)角度分享一下疫苗檢測中的創(chuàng)新應(yīng)用。

HPLC方法檢測疫苗中的主成分

蛋白質(zhì)疫苗在預(yù)防肝炎，帶狀皰疹病毒，HPV感染，新冠病毒和其他病毒感染起到了非常重要的應(yīng)用，除了經(jīng)典的酶聯(lián)免疫的方法。液相色譜法因檢測方法簡單，重復(fù)性好，越來越多應(yīng)用于蛋白總量的測定。核酸疫苗的研發(fā)和生產(chǎn)中，HPLC技術(shù)的應(yīng)用也解決了一些檢測難題。

SEC方法檢測目標(biāo)蛋白總量

-BIOBASIC SEC 120 

BIOASIC SEC-120色譜柱檢測分子量比較小的用于豬的疫苗蛋白總含量測定，重復(fù)性良好。優(yōu)于酶聯(lián)免疫法偏差較大的結(jié)果。

SEC方法檢測人免疫球蛋白二聚體

-MAbPac SEC-1

SEC方法是檢測蛋白類制劑中的聚體分析的經(jīng)典方法。5 μm的300?孔徑的MAbPac SEC-1色譜柱可以快速分析人血白蛋白的聚體和單體。

疫苗分子量，結(jié)構(gòu)和組成不同，我們有不同排阻范圍的柱子選擇，下面是我們可以用于疫苗檢測的一些SEC柱子信息，可以用于快速蛋白純度測定和含量測定。

RP方法檢測蛋白組成-MAbPac RP

蛋白類疫苗需要檢測目標(biāo)蛋白的含量，對于抗體類蛋白，可以采用親和色譜法快速定量，重組蛋白常用電泳法，免疫化學(xué)法等方法，很少使用反相色譜法進(jìn)行。因?yàn)橐呙绯煞直容^復(fù)雜，常規(guī)的硅膠基質(zhì)反相色譜柱，孔徑比較小，不耐堿洗等因素。新型的耐堿性聚合物基質(zhì)的MAbPac RP色譜柱，可以在檢測該重組疫苗蛋白，在0.1 mg/mL-2.5 mg/mL范圍內(nèi)線性良好。用于蛋白疫苗定量檢測。

SEC方法檢測mRNA聚體

-BIOBASIC SEC 1000

尺寸排阻色譜法（SEC）是用于聚體分析的經(jīng)典方法，硅膠基質(zhì)的BIOBSIC SEC 1000可以將該2000 nt的聚體與單體分開。

RP方法檢測mRNA雜質(zhì)-DNAPac RP

反相色譜法是在變性條件下分析mRNA的雜質(zhì)，DNAPac RP 1500?的孔徑，可以用于不同堿基對大小的mRNA的分離。

IEC方法檢測mRNA雜質(zhì)-DNAPac PA200

離子交換色譜法在非變性條件下分析mRNA雜質(zhì)，可以用于監(jiān)控mRNA工藝中雜質(zhì)的去除情況。也可以用于成品中mRNA完整性的檢測。

HPLC方法檢測疫苗生產(chǎn)中的工藝組分

疫苗生產(chǎn)過程中會(huì)引入各類潛在風(fēng)險(xiǎn)物質(zhì)，在生產(chǎn)過程中會(huì)引進(jìn)一些滅活劑，裂解劑，凍干保護(hù)劑等制劑，為了增加免疫持久性，調(diào)節(jié)親和力會(huì)加入一些佐劑，賦型劑，防腐劑等組分。特色液相色譜柱在CAD檢測器下可以快速進(jìn)行這類組分的檢測。

RP方法檢測戊二醛-Acclaim 120 C18

戊二醛具有甲醇含量低，無致畸變，無積毒的特點(diǎn)，越來越被廣泛用于滅活。DNPH衍生后的戊二醛可以產(chǎn)生兩個(gè)衍生產(chǎn)物，兩個(gè)產(chǎn)物都可以在Acclaim 120 C18柱上得到很好的分離，在戊二醛在0.4 μg/mL-10.0 μg/mL范圍內(nèi)線性良好。

陰離子交換反相方法檢測去氧膽酸

-Acclaim Surfactant

去氧膽酸是一種裂解劑，可以裂解病毒顆粒后經(jīng)過純化去除部分病毒成分，有效降低不良反應(yīng)。Acclaim Surfactant Plus色譜柱采用陰離子交換和RP雙重保留機(jī)理，可以在CAD檢測器下分離和定量不同的去氧膽酸。

陰離子交換反相色譜法快速檢測吐溫80

-Retain AX 

吐溫80也可以用于裂解病毒顆粒，分光光度法因其萃取時(shí)間較長，導(dǎo)致分析時(shí)間比較長，使用Hypersep Retain AX色譜柱可以避免復(fù)雜的樣品前處理，直接定量生物制劑中的吐溫80含量。

陰離子交換，RP色譜法分析PEG組成

-Accliam Surfactant Plus

對聚乙二醇（PEG）評(píng)估時(shí)，希望在色譜上對其進(jìn)行盡可能的分離，以獲得指紋譜圖，進(jìn)行更好的質(zhì)量控制。Acclaim? Surfactant Plus是一款表面活性劑專用柱，尤其適合分析聚合物類的輔料，在對不同聚合度的PEG分析 時(shí)，都能夠獲得優(yōu)秀的峰型和分離度。

HILIC分析蔗糖-Hypersil APS-2

蔗糖，乳糖添加在活性物質(zhì)濃度較低的疫苗中，減少冷凍干燥時(shí)被升華的氣流帶走并且使凍干后的產(chǎn)品能形成較理想的團(tuán)塊。Hypersil APS-2在分析蔗糖，乳糖時(shí)，峰對稱度好，定量準(zhǔn)確。

RP分析膽固醇、DPPC、Lyso-PC和皂苷分析-Hypersil Gold PFP

HPLC方法檢測疫苗載體

RP分析納米脂質(zhì)體組成-Acclaim 300 C18

RP分析納米脂質(zhì)體組成-Accucore C30

納米脂質(zhì)體是一種非常有前景的藥物載體，可以有效保護(hù)mRNA等藥物運(yùn)輸?shù)郊?xì)胞中，脂質(zhì)體的組成和比例會(huì)影響藥物的包裹率和穩(wěn)定性，300?的Acclaim C18色譜柱和80?的Accucore C30色譜柱可以將納米脂質(zhì)體中的幾種組分分開。

IEC分析AAV包裹率-ProPac3R SAX 

AAV用于藥物載體中，其包裹率通常通過超速離心的方法測定，但是檢測時(shí)間比較長，儀器成本也比較高。新型的，單分散的3um的強(qiáng)陰離子交換柱ProPac 3R SAX可以將不同亞型的包裹的AAV與空殼的AAV分開，并且可以得到雜質(zhì)峰。

疫苗接種是預(yù)防控制傳染病最有效的手段，新冠疫情中多種不同技術(shù)路徑的疫苗均用于防疫中，其中核酸疫苗帶來重要變革。相信新的檢測手段和方法會(huì)在疫苗領(lǐng)域有更廣泛的應(yīng)用。

       新冠病毒依舊在范圍內(nèi)“肆虐”，目前累計(jì)確診人數(shù)已超過1000萬人次；現(xiàn)在所關(guān)心的，除了病例數(shù)據(jù)，Z受關(guān)注的莫過于疫苗研發(fā)；疫苗被寄予徹底終結(jié)疫情的厚望，可以說，只有研發(fā)出有效的新冠疫苗，人類才能在這場沒有硝煙的“戰(zhàn)爭”中取得勝利，然而，世界衛(wèi)生組織不止一次強(qiáng)調(diào)疫苗的開發(fā)很難在18個(gè)月內(nèi)完成，而Z近幾年人類的疫苗研發(fā)往往耗時(shí)數(shù)年。

目前WHO網(wǎng)站帶來了好消息，

世界上共有10款候選疫苗已進(jìn)入臨床試驗(yàn)，

另有120多種疫苗處于臨床前試驗(yàn)階段。

       此前世界衛(wèi)生組織（WHO）總干事譚德塞宣布與合作伙伴共同發(fā)起“合作加速開發(fā)、生產(chǎn)、公平獲取新冠肺炎防控新工具”的倡議。在歐盟主辦的應(yīng)對新冠肺炎疫情國際認(rèn)捐大會(huì)上，這一倡議得到廣泛支持，各國承諾提供74億歐元資金，用于推動(dòng)新冠疫苗研發(fā)、生產(chǎn)以及公平分配等。

       各大制藥企業(yè)，都在進(jìn)一步擴(kuò)大和加快新冠疫苗研發(fā)，來遏制這場疫情。目前，深圳某生物YL科技有限公司在深圳高新區(qū)擬覓址投資建設(shè)mRNA藥物疫苗產(chǎn)品生產(chǎn)基地，開展臨床前研究；該公司利用人工智能深度學(xué)習(xí)算法篩選抗原靶點(diǎn)，并以此為基礎(chǔ)平臺(tái)開發(fā)mRNA藥物疫苗，目前在研項(xiàng)目有新冠病毒體液免疫及細(xì)胞免疫疫苗與腫瘤新抗原ZL性疫苗，產(chǎn)品已完成初步研發(fā)。此前該公司與安東帕公司完成了納米粒度儀Litesizer的采購計(jì)劃，用于疫苗的進(jìn)一步研發(fā)和臨床試驗(yàn)。

       抗病毒疫苗的顆粒尺寸對其免疫原性和保質(zhì)期具有重要影響，安東帕Litesizer采用動(dòng)態(tài)光散射 (DLS) 快速有效地測量滅活病毒粒子的顆粒尺寸，以及商用抗病毒疫苗中使用的鋁鹽佐劑的顆粒尺寸，通過模擬冷鏈中斷（熱處理、凍融）會(huì)引起顆粒大小分布的顯著變化，可發(fā)現(xiàn)Litesizer 是進(jìn)行抗病毒疫苗質(zhì)量控制的有效工具。