上一期，我們通過(guò)了解動(dòng)物恐懼記憶相關(guān)的兩種研究——穿梭實(shí)驗(yàn)與跳臺(tái)實(shí)驗(yàn)，探究了通過(guò)特定的場(chǎng)景刺激（強(qiáng)光、電流和聲音等）使小鼠產(chǎn)生恐懼記憶，經(jīng)過(guò)一定時(shí)間強(qiáng)化后，環(huán)境與刺激兩者被小鼠聯(lián)系在一起，當(dāng)小鼠再次回到該環(huán)境中便會(huì)出現(xiàn)恐懼相關(guān)行為的兩種實(shí)驗(yàn)流程。

本期，我們將繼續(xù)介紹兩種研究小鼠恐懼記憶的測(cè)試——避暗實(shí)驗(yàn)與巴恩斯迷宮實(shí)驗(yàn)，探究動(dòng)物大腦儲(chǔ)存恐懼記憶的奧秘。

避暗實(shí)驗(yàn)

01.原理

利用鼠類的嗜暗習(xí)性設(shè)計(jì)，主要測(cè)試動(dòng)物對(duì)明暗辨別覺(jué)的學(xué)習(xí)記憶能力。動(dòng)物由于嗜暗習(xí)性而偏好進(jìn)入和停留在暗室，當(dāng)動(dòng)物進(jìn)入暗室或停留暗室時(shí)則會(huì)受到電擊，動(dòng)物為了避免受到電擊傷害就會(huì)尋找安全區(qū)（明室），經(jīng)幾次反復(fù)后，ZZ記住安全區(qū)域。

02.實(shí)驗(yàn)材料

03.實(shí)驗(yàn)方法

適應(yīng)期

實(shí)驗(yàn)開(kāi)始前3-7天，每天抓取、輕撫動(dòng)物，讓其適應(yīng)被實(shí)驗(yàn)人員抓取，避免實(shí)驗(yàn)過(guò)程中因?qū)嶒?yàn)人員抓取而造成動(dòng)物處于應(yīng)激狀態(tài)，造成實(shí)驗(yàn)結(jié)果不可靠的問(wèn)題。

建模期

① 時(shí)間：第 一天② 強(qiáng)度：

• 大鼠：電流：0.65-1.8mA（推薦0.8mA），或，電壓65-70V。

• 小鼠：電流：0.15-0.6mA（推薦0.25mA），或，電壓30-36V。

③ 頻率：5-15Hz電流。

④ 刺激方法：實(shí)驗(yàn)開(kāi)始前，將動(dòng)物放入暗箱，適應(yīng)5分鐘。隨后對(duì)暗箱進(jìn)行通電，持續(xù)5分鐘，此時(shí)明箱底部沒(méi)有通電。

測(cè)試期

① 時(shí)間：第二天② 方法：將動(dòng)物放進(jìn)明箱，不進(jìn)行通電，記錄5分鐘。

04.數(shù)據(jù)分析

①物活動(dòng)軌跡，動(dòng)物第 一次進(jìn)入暗箱的時(shí)間（潛伏期），分別在兩個(gè)箱體的活動(dòng)時(shí)間，活動(dòng)距離。

② P<0.05認(rèn)為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性差異。

05.注意事項(xiàng)

• 選擇體重均勻動(dòng)物進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，測(cè)試時(shí)大鼠體重需<300g，確保體重不影響電擊效果。

• 不同品系動(dòng)物本身會(huì)有區(qū)別，常規(guī)推薦使用C57BL/6J小鼠和SD大鼠。

• 實(shí)驗(yàn)前后注意清理電擊柵欄中的動(dòng)物排泄物（排泄物會(huì)影響通電性及損壞電發(fā)生器）。

• 環(huán)境清理，通過(guò)酒精擦拭、晾干盡可能去除上一只動(dòng)物氣味，儀器設(shè)備具有通風(fēng)性。

巴恩斯迷宮實(shí)驗(yàn)

01.原理

1979年，Barnes 建立了巴恩斯迷宮，與水迷宮和放射臂迷宮類似，它是基于嚙齒類動(dòng)物天生的探索特性，應(yīng)用噪音、強(qiáng)光和暴露的開(kāi)放環(huán)境作為應(yīng)激手段，促使動(dòng)物尋找目標(biāo)洞。經(jīng)過(guò)訓(xùn)練，動(dòng)物學(xué)習(xí)并記憶目標(biāo)箱的位置。該實(shí)驗(yàn)的優(yōu)點(diǎn)在于對(duì)動(dòng)物的應(yīng)激性刺激較小，既不像放射臂迷宮那樣需要禁食，也不像水迷宮那樣應(yīng)激性強(qiáng)。因此，在記憶研究中較為常用。尤其適用于與應(yīng)激相關(guān)的記憶研究以及基因敲除小鼠的行為表型研究。

02.實(shí)驗(yàn)材料

巴恩斯迷宮，smart3.0

03.實(shí)驗(yàn)方法

① 實(shí)驗(yàn)開(kāi)始前3-7天，每天抓取、輕撫動(dòng)物，讓其適應(yīng)被實(shí)驗(yàn)人員抓取，避免實(shí)驗(yàn)過(guò)程中因?qū)嶒?yàn)人員抓取而造成動(dòng)物處于應(yīng)激狀態(tài)，造成實(shí)驗(yàn)結(jié)果不可靠的問(wèn)題。

② 實(shí)驗(yàn)第1天，將動(dòng)物從目標(biāo)孔洞放入目標(biāo)箱內(nèi)適應(yīng)4分鐘（只進(jìn)行這一次）。

③ 實(shí)驗(yàn)第2-7天，將動(dòng)物移動(dòng)至平臺(tái)中 央，用透明圓筒限制活動(dòng)5秒，后撤掉圓筒開(kāi)始計(jì)時(shí)，同時(shí)給與動(dòng)物刺激（強(qiáng)光，聲音等）。

• 動(dòng)物成功進(jìn)入目標(biāo)箱，則讓動(dòng)物在目標(biāo)箱內(nèi)停留30秒。

• 若動(dòng)物4分鐘內(nèi)沒(méi)有找到目標(biāo)箱，則誘導(dǎo)動(dòng)物進(jìn)入目標(biāo)箱，停留30秒。

④ 隨機(jī)轉(zhuǎn)動(dòng)圓盤，使孔位與上一次實(shí)驗(yàn)不同，但目標(biāo)箱的方位始終保持不變。每天重復(fù)2次上一步的實(shí)驗(yàn)流程。

04.數(shù)據(jù)分析

① 第 一次探究洞的潛伏期，到達(dá)目標(biāo)洞的時(shí)間，每只動(dòng)物的錯(cuò)誤次數(shù)（探究一個(gè)錯(cuò)誤的洞即視為錯(cuò)誤一次）。

• 潛伏期僅做參考，潛伏期越短，說(shuō)明動(dòng)物學(xué)會(huì)了迷宮原理，記憶水平越好。

• 到達(dá)目標(biāo)洞的時(shí)間越短，說(shuō)明動(dòng)物記憶水平越好。

• 動(dòng)物錯(cuò)誤次數(shù)越多，說(shuō)明動(dòng)物學(xué)會(huì)了迷宮原理，但沒(méi)有記住目標(biāo)箱的位置。

② 采用單因素方差分析（one way-ANOVA），當(dāng)多組間有差異時(shí)，兩兩比較采用Fisher's LSD post hoc多重比較方法。

③P<0.05認(rèn)為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性差異。

05.注意事項(xiàng)

• 每只動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)束后應(yīng)進(jìn)行環(huán)境清理，盡可能去除上一只動(dòng)物的氣味。

• 不同品系動(dòng)物對(duì)此實(shí)驗(yàn)的偏好性有很大不同，建議使用C57BL/6J小鼠進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

【參考文獻(xiàn)】

Rosenfeld Cheryl S,Ferguson Sherry A,Barnes maze testing strategies with small and large rodent models.[J] .J Vis Exp, 2014, undefined: e51194.

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