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  lfv的春天 2017-11-28 00:00:00

  化學物質(zhì)與蛋白質(zhì)的相互作用 化學物質(zhì)與蛋白質(zhì)的的沉淀作用 沉淀作用的類型 可逆沉淀 定義： 在溫和條件下， 通過改變?nèi)芤旱?pH 或電荷狀況， 使蛋白質(zhì)從膠體溶液中沉淀分離。 蛋白質(zhì)在沉淀過程中， 結構和性質(zhì)都沒有發(fā)生變化， 在適當條件下， 可以重新溶解形成溶液， 所以這種沉淀又稱為非變類型： 可逆沉淀是分離和純化蛋白質(zhì)的基本方法， 如等電點沉淀法、 鹽析法和有機溶劑沉淀法等。 不可逆沉淀 定義： 在強烈沉淀條件下， 不僅破壞了 蛋白質(zhì)膠體的溶液的穩(wěn)定性， 而且也破壞了蛋白質(zhì)的結構和性質(zhì)， 產(chǎn)生的蛋白質(zhì)沉淀不可能再溶解于水。 由于沉淀過程中發(fā)生了蛋白質(zhì)結構和性質(zhì)的變化， 所以又稱為變性沉淀。 類型： 加熱沉淀、 強酸堿沉淀、 重金屬鹽沉淀等 沉淀劑的類型 無機物沉淀 鹽析 定義： 低濃度的中性鹽可以增加蛋白質(zhì)的溶解度， 此現(xiàn)象叫鹽溶。 繼續(xù)向蛋白質(zhì)溶液中加入大量的中性鹽（硫酸銨、 硫酸鈉、 氯化鈉） 使蛋白質(zhì)沉淀析出的現(xiàn)象叫做鹽析（水與離子的相互作用增加了蛋白質(zhì)表面的疏水補丁的相互作用； 同時瓦解了 以電荷為基礎的蛋白質(zhì)分子之間的作用） 。 鹽析方程： lgS=lgS0-KSI S0 -離子強度為零時的溶解度 S-蛋白質(zhì)在某一離子強度溶液中的溶解度 KS -鹽析常數(shù) diyi類： Mn2+、 Fe2+、 Co2+、 Ni2+、 Cu2+、 Zn2+、 Cd2+，能和蛋白質(zhì)分子表面的羧基、氨基、 咪唑基、 胍基等側鏈結合 第二類： Ca2+、 Ba2+、 Mg2+、 Pb2+、 能和蛋白質(zhì)分子表面的羧基結合， 但不能和含氮化合物結合 金屬離子沉淀法 第三類： Ag2+、 Hg2+、 Pb2+、 能和蛋白質(zhì)分子表面的巰基等側鏈相結合 優(yōu)點： 在稀溶液中對蛋白質(zhì)有較強的沉淀能力。 處理后殘余的金屬離子可以用離子交換樹脂和螯合劑除去。 等電點沉淀 定義： 在低的離子強度下， 用無機或有機酸堿調(diào) PH 至等電點， 使蛋白質(zhì)所帶靜電荷為零， 能大大降低其溶解度。 （適用于巰水性較強的蛋白質(zhì)。 ） 主要優(yōu)點： 很多蛋白質(zhì)的等電點都在偏酸范圍內(nèi)， 而無機酸通常較廉價， 并且某些酸， 如磷酸、 鹽酸、 和硫酸的應用能為蛋白質(zhì)食品所允許。 同時， ?？芍苯舆M行其他純化操作， 無需將殘余的酸除去。 主要缺點： 酸化時易使蛋白質(zhì)失活， 這是由于蛋白質(zhì)對于低 PH 比較敏感所致。 有機物沉淀 優(yōu)點： 溶劑容易蒸發(fā)除去， 不會殘留在成品中， 因此適用于制備食品蛋白質(zhì)。 而且有機溶劑密度低， 與沉淀物密度差大， 便于離心分離。 原理： 加入有機溶劑于蛋白質(zhì)溶液中產(chǎn)生多種效應， 這些效應結合起來使蛋白質(zhì)沉淀。 主要效應是水活度的降低。 （Z常用的溶劑是乙醇和丙酮） 有機溶劑 缺點： 容易使蛋白質(zhì)變性失活， 且有機溶劑易燃、 易爆、 安全要求高。 酚類化合物 定義： 當?shù)鞍踪|(zhì)溶液 PH 小于其等電點時， 蛋白質(zhì)顆粒帶有正電荷， 容易與酚類化合物或有機酸酸根所帶的負電荷發(fā)生作用生成不溶性鹽而沉淀。 （這類化合物包括鞣酸、 、 三、 磺酰水楊酸等） 聚合物沉淀 及有機酸沉淀 非離子型聚合物 定義： 許多非離子型聚合物， 包括聚乙二醇（PEG） 可用來進行選擇性沉淀以純化蛋白質(zhì)。 聚合物的作用認為與有機溶劑相似， 能降低水化物， 使蛋白質(zhì)沉淀。 PDE 的使用:低分子量的蛋白質(zhì)沉淀加入大量 PDE， 反之亦然。 所用的 PDE 的濃度通常為 20%， 濃度再高，會使粘度增大， 造成沉淀的回收比較困難。 且其不必除去。 聚電解質(zhì)沉淀法 定義： 有一些離子型多糖化合物可應用于沉淀食品蛋白質(zhì)。 如羧甲基纖維素， 海藻酸鹽、 果膠酸鹽、 卡拉膠等。 原理： 主要作用力是靜電引力。 （加入量不能太多， 否則會引起膠融作用而重新溶解。 ） 化學物質(zhì)對蛋白質(zhì)的穩(wěn)定作用 蛋 白質(zhì) 不可 逆失 活的 化學 因素 強酸和強堿： 強的無機酸堿以及有機酸堿都可以改變蛋白質(zhì)的 pH，引起蛋白質(zhì)表面必須基團的電離； 由于各氨基酸殘基所帶電荷的相互吸引或者相互排斥使蛋白質(zhì)的空間結構發(fā)生較大變化， 造成蛋白質(zhì)分子聚集， 導致不可逆失活； 在強酸、 強堿條件下， 肽鍵也容易發(fā)生斷裂。 氧化劑： 各種氧化劑能夠氧化芳香族側鏈的氨基酸以及甲硫氨酸、 半胱氨酸、 和胱氨酸殘基； 分子氧、 過氧化氫氧自由基等是Z常見的氧化劑。 在生物體內(nèi)， 蛋白質(zhì)的失活主要是通過活性氧（羥基自由基、 超氧離子、 過氧化氫、 過氧化物等來完成的。 ） 去 污 劑 和 活性表面劑： 離子表面活性劑： 陰離子： 如 SDS(十二烷基硫酸鈉)陽離子： 癸基三甲基氯化銨、 十六烷基三甲基氯化銨等， 對蛋白質(zhì)的變形能力比陰離子弱。 非離子去污劑： 通常不能使蛋白質(zhì)變性。 變性劑 脲和鹽酸胍： 高濃度的脲（8~10mol/L） 和鹽酸胍（6mol/L） 與蛋白質(zhì)多肽鏈作用， 破壞蛋白質(zhì)分子內(nèi)維持其二級結構和高級結構的氫鍵， 引起蛋白質(zhì)不可逆失活。 有機溶劑： 取代蛋白質(zhì)表面的結合水， 并通過疏水作用與蛋白質(zhì)結合， 改變?nèi)芤旱慕殡姵?shù)， 從而影響維持蛋白質(zhì)天然構想的非共價力的平衡。 螯合劑： EDTA 與金屬離子形成配位聚合物， 從而使酶失去金屬輔助因子， 從而導致酶或者蛋白質(zhì)的構想發(fā)生較大的改變， 導致蛋白質(zhì)不可逆失活。 重 金 屬 離 子和巰基試劑 重金屬離子： （如 Hg2+、 Cd2+、 Pb2+等） 能與能與蛋白質(zhì)分子中的半胱氨酸的巰基、 組氨酸的咪唑基、 色氨酸的吲哚基反應， 使蛋白質(zhì)不可逆失活。 巰基試劑： （如巰基乙醇） 通過還原蛋白質(zhì)分子內(nèi)的二硫鍵使蛋白質(zhì)失活（一般可逆） 。 低分子量的含二硫鍵的試劑可以與蛋白質(zhì)分子中的的巰基作用， 使蛋白質(zhì)失活。 蛋白質(zhì)的穩(wěn)定 常 用 方法：固化法： 將酶或者蛋白質(zhì)多點連接于載體上。 添加劑： 保護蛋白質(zhì)不受氧化劑氧化， 不受變性劑變性 化學修飾： 共價交聯(lián)， 使蛋白質(zhì)構想固化。 添加劑 共溶劑： 糖類、 醇、 氨基酸及其衍生物、 無機鹽、 甘油、 多聚物（如聚乙二醇） 等被稱為蛋白質(zhì)共溶劑。 其改變?nèi)芤旱臒崃W性質(zhì)， 在蛋白質(zhì)表面完全水化和共溶劑完全結合之間建立平衡， 使天然蛋白質(zhì)穩(wěn)定性增強， 理論上成為優(yōu)先排阻作用。 抗氧化劑和還原劑： 蛋白質(zhì)表面的半胱氨酸極容易被空氣中的氧緩慢氧化而變成次磺酸或者二硫化物， 從而使蛋白質(zhì)的電荷或者形狀發(fā)生改變而失活。 （加入一些巰基試劑或者植物蛋白質(zhì)課防止這種氧化。 ） 底物、 輔酶： 一些酶可以被底物、 輔酶或者競爭性YZ劑及反應產(chǎn)物所穩(wěn)定。 其可能是降低活性ZX的能量水平， 使酶趨于穩(wěn)定。 金屬離子： 如 Ca2+的存在可以穩(wěn)定枯草桿菌蛋白酶、 灰色鏈絲菌蛋白酶和胰蛋白酶等， Ca2+與這些蛋白質(zhì)的結合相當于與底物結合。 重金屬離子可能引起酶活性YZ。 都具有長鏈疏水尾 和 親水的 極性頭 具有兩個反應活性部位的雙功能基團 同行雙功能試劑： 兩端具有相同的活性反應基團， 如 N-羥基琥珀酰亞胺酯， 二硝基氟苯、 雙亞胺基酯等對氨基有專一性， 戊二醛也可與羥基反應。 異性雙功能交聯(lián)劑： 一端與氨基作用， 另一端與巰基作用（用碳二亞胺做交聯(lián)劑， 第二個反應基團是羧基） 。 可被光活化的交聯(lián)劑： 一端先于蛋白質(zhì)反應， 經(jīng)光照后， 另一端再產(chǎn)生一個活性基團， 如碳烯或者氮烯， 他們具有較高反應性，沒有專一性。 可裂解型交聯(lián)劑: 不可裂解型交聯(lián)劑 化學交聯(lián)劑 化學物質(zhì)對蛋白質(zhì)側鏈基團的共價修飾作用外源化合物與生物大分子相互作用主要兩個方式 共價結合： 當外源化合物的活性代謝產(chǎn)物與細胞內(nèi)重要生物大分子共價結合時， 發(fā)生烷基化或芳基化，導致 DNA 損傷， 蛋白質(zhì)正常功能喪失， 乃至細胞的損傷和死亡。 非共價結合 生物體內(nèi)蛋白質(zhì)加合物的形成 可與蛋白質(zhì)發(fā)生反應的化合物（課本 148 頁表格） ： 除少數(shù)烷化劑外， 絕大多數(shù)外源化合物需經(jīng)體內(nèi)代謝活化， 轉為親電子的活性代謝物再與細胞內(nèi)生物大分子的親核部位和基團發(fā)生共價結合。 蛋白質(zhì)分子中的可反應基團： 氨基酸分子中的氨基和羧基、 絲氨酸和蘇氨酸特有的羥基、 半胱氨酸分子中的巰基， 精氨酸分子中的胍基、 組氨酸分子中的咪唑基、 酪氨酸分子內(nèi)中的酚基、 色氨酸分子中的吲哚基。 這些部位與源化合物發(fā)生共價結合， 會影響蛋白質(zhì)的結構和功能。 與蛋白質(zhì)的共價結合： 白蛋白是血液和組織間質(zhì)中的主要蛋白質(zhì)， 也是脂肪酸、 內(nèi)源性（生物體內(nèi)存在） 化合物及外源性（非生物體內(nèi)存在） 化合物運輸?shù)闹饕d體， 容易與終致癌物結合形成共價加合物。 與血紅蛋白共價結合： 外援化合物進入血液后， 可與紅細胞膜結合而進入紅細胞內(nèi)與血紅蛋白發(fā)生共價結合。 與細胞內(nèi)蛋白質(zhì)發(fā)生共價結合： 進入體內(nèi)的外源化合物或其代謝產(chǎn)物可與漿胞、 質(zhì)膜以及細胞核內(nèi)的蛋白質(zhì)發(fā)生共價結合形成加合物。 （如溴苯一種重要的肝臟毒物） ； 有些非遺傳毒性致癌物與漿胞蛋白或者核蛋白共價結合， 對細胞造成不利影響。 特定的氨基酸殘基側鏈基團的修飾 蛋白質(zhì)側鏈基團的修飾是通過選擇性的試劑或親和標記試劑與蛋白質(zhì)分子側鏈上特定的功能基團發(fā)生化合反應來實現(xiàn)的。 修飾試劑的作用不專一， 不但與蛋白質(zhì)必須基團作用， 也和非必須基團作用。 巰基化學修飾 烷基化試劑是一種重要的巰基修飾試劑， 尤其是碘乙酸和碘乙酰胺， 可用于多肽鏈氨基酸順序分析過程中防止半胱氨酸的氧化。 N-乙基馬來酰亞胺： 有較強的專一性， 伴隨光變化， 容易通過光吸收變化確定反應程度。 5，5`-二硫-2-硝基苯甲酸（DTNB） ： 又稱 Ellman 試劑， Z常用的巰基修飾試劑， 可通過光吸收變化確定反應程度 有機汞試劑： Z常用對氯汞苯甲酸， 溶于水中形成羥基衍生物， 與巰基相互作用時在 255nm 處光吸收具有較大的增應。 氨基化學修飾： 賴氨酸殘基可被選擇性修飾， 三硝基苯磺酸（TNBS） 與賴氨酸殘基發(fā)生反應， 在 420nm 處和 367nm 處有光吸收 羧基化學修飾： 水溶性的碳化二亞胺類化學物可修飾蛋白質(zhì)分子中的羧基基團 咪唑基的化學修飾： 組氨酸殘基的咪唑基課通過氮原子的烷基化或碳原子的親核取代來修飾， 常用焦炭酸（DPC） 二乙脂來修飾 酚和脂肪族羥基的化學修飾： 四硝基甲烷(TNM)可用于修飾絡氨酸殘基， 產(chǎn)生離子化的發(fā)色基團——3-硝基絡氨酸衍生物。 胍基的化學修飾： 苯乙二醛： 兩分子苯乙二醛與一份子精氨酸殘基不可逆結合。 精氨酸殘舊修飾試劑（如 4-羥基-3-硝基苯乙二醛） 可使被修飾的精氨酸殘基在 405nm 處具有光吸收。 對硝基苯乙二醛修飾精氨酸殘基可以得到唯yi產(chǎn)物。 親和性標記： 對于底物或者配體的結合部位具有一定親和性， 因而能夠結合選擇性的結合在蛋白質(zhì)的表面上的特定部位； 由于它們的化合反應性， 這類類似物能夠與蛋白質(zhì)分子共價結合； 這類反應試劑具有飽和性， 與底物或者天然配體競爭蛋白質(zhì)的結合位點。 主要有光親和標記和自殺性YZ劑兩種類型， 自殺性YZ劑作為底物沒有反應活性。 丁二酮和 1，2-環(huán)己二酮與胍基反應可逆生成精氨酸-丁二酮復合物， 該物與硼酸結合穩(wěn)定。 蛋白質(zhì)光譜探針 蛋白質(zhì)吸光探針 金屬探針 雙縮脲法： 雙縮脲與堿性溶液中與二價銅離子生成紫紅色化合物， 具有 2 個和 2 個以上化合物都具有雙縮脲反應， 紫紅色化合物可在 540nm 處測量吸光度 Folin-Lowry 法： Lowry 等將雙縮脲試劑和 Folin 酚試劑結合使用， 在蛋白質(zhì)發(fā)生雙縮脲反應之后， 再和 Folin 酚試劑反應， 此試劑在堿性條件下被蛋白質(zhì)中絡氨酸的酚基還原， 生成顏色更深的化合物， 可在 640nm 處測量。 雙辛可寧酸法（BCA 法） ： 在堿性條件下， 蛋白質(zhì)分子中的肽鍵與銅離子反應生成 Cu（I） 、 Cu(I)再與 BCA 反應形成紫色絡合物， 在 565nm 測量吸光度。 染料探針 原理： 利用蛋白質(zhì)和染料結合成沉淀或者改變結合燃料的光吸收特性， 借助燃料顏色的顏色的減退或減退變化的程度來測定蛋白質(zhì)的含量。 溴酚藍： 該試劑顏色對比度為 160nm， 反應在 pH3.2 左右進行， 在 600nm 測量吸光度。 溴甲酚綠： 對比度約為 170nm， 反應在 pH4.2 進行， 628nm 測量吸光度。 考馬斯亮藍： 在酸性條件下， 考馬斯亮藍與蛋白質(zhì)結合。 其吸收高峰從 465nm 移至 595nm， 顏色由棕黃色轉為深藍色 蛋白質(zhì)熒光探針 蛋白質(zhì)光散射探針 蛋白質(zhì)分子中存在絡氨酸、 色氨酸、 苯丙氨酸殘基， 能夠吸收 270~300nm 的紫外光而發(fā)出紫外熒光。 小分子配體能與蛋白質(zhì)發(fā)生相互作用， 導致蛋白質(zhì)熒光的淬滅， 利用小分子配體對蛋白質(zhì)內(nèi)源性熒光的淬滅這一現(xiàn)象可以確定蛋白質(zhì)與小分子配體的作用類型及結合部位。 作為一個好的熒光探針滿足的條件 1.探針分子與蛋白質(zhì)分子的某一微區(qū)必須有特異性的結合， 并且結合比較牢固； 2.探針的熒光必須對環(huán)境條件敏感 3.蛋白質(zhì)分子與探針結合后不影響其原來的結構和特性。

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