如何選擇緩沖劑？

選擇緩沖體系，其解離常數(shù)pKa值應(yīng)該在設(shè)定的pH上下一個(gè)pH值單位內(nèi)，因?yàn)榫彌_液的pKa變化超過(guò)一個(gè)pH單位時(shí)，其緩沖能力就會(huì)明顯下降；

緩沖體系不應(yīng)影響蛋白質(zhì)的活性或者DNA的穩(wěn)定性，并避免其他離子的干擾；

另外，還要考慮溫度的影響：溫度不僅對(duì)緩沖液有影響，對(duì)細(xì)胞也有影響，大多數(shù)動(dòng)物細(xì)胞在37℃的生理狀況下pH為7.0~7.5，而在溫度下降到0℃時(shí)可達(dá)到8.0。

一、磷酸鹽緩沖液的優(yōu)缺點(diǎn)：

是使用很廣泛的一種緩沖劑，由于它有二級(jí)解離，所以緩沖的pH值范圍很廣，可配置各種pH值的酸性、堿性和中性緩沖液。

優(yōu)點(diǎn)：

易配成各種濃度

適用pH范圍寬

pH受溫度影響小

稀釋后pH變化小

缺點(diǎn)：

易與常見(jiàn)的鈣離子、鎂離子及重金屬離子締合成沉淀。

二、Tris緩沖液的優(yōu)缺點(diǎn)：

Tris緩沖液是在生物化學(xué)研究中使用較廣泛的一種緩沖劑，其本身為弱堿，常用有效pH在“中性”范圍。

優(yōu)點(diǎn)：

堿性較強(qiáng)，可以只用這一種緩沖液配置由酸到堿的但范圍pH緩沖液；

對(duì)生物化學(xué)過(guò)程干擾很小，不與鈣、鎂離子及重金屬離子發(fā)生沉淀；

易吸收空氣中的CO2，所以配制的緩沖液要蓋嚴(yán)密封；

此緩沖液對(duì)某些pH電極發(fā)生一定干擾作用，所以要使用與Tris溶液具有兼容性的電極。

缺點(diǎn)：

pH受濃度影響較大，稀釋10倍，pH變化大于0.1

溫度效應(yīng)大，如4℃時(shí)pH=8.4，37℃時(shí)pH=7.4

三、HEPES緩沖液的優(yōu)缺點(diǎn)：

HEPES是一種非離子兩性緩沖液，其在pH7.2~7.4范圍內(nèi)具有較好的緩沖能力，常用在生化診斷試劑盒、DNA/RNA提取試劑盒及PCR診斷試劑盒里。

優(yōu)點(diǎn)：

在開(kāi)放式培養(yǎng)或細(xì)胞觀察時(shí)能維持較恒定的pH值，并對(duì)細(xì)胞無(wú)毒性作用。

缺點(diǎn)：

在高濃度時(shí)對(duì)一些細(xì)胞可能有毒，與其他緩沖劑相比價(jià)格略貴。

四、PIPES緩沖液的優(yōu)缺點(diǎn)：

PIPES是哌嗪緩沖液家族的一員，與HEPES屬于同一家族。它是兩性離子Good's緩沖液，在6.1至7.5的pH范圍內(nèi)有效。由于pH范圍與HEPES略有不同，PIPES的濃度僅為HEPES濃度的一半。

優(yōu)點(diǎn)：

該緩沖劑不會(huì)與金屬絡(luò)合，因此可用于含金屬離子的溶液；

可以用于色譜分析，電子顯微鏡固定植物細(xì)胞，以及代替草甘膦緩沖液。

缺點(diǎn)：

當(dāng)溶液的pH值升高到6.5以上時(shí)，PIPES的游離酸才容易溶解，但是PIPES的鈉鹽很容易溶解；

如果使用的是游離酸形式的緩沖液，請(qǐng)使用氫氧化鈉將其轉(zhuǎn)化為鈉鹽，以提高在較低pH下的溶解度；

像HEPES一樣，PIPES不適用于涉及氧化還原反應(yīng)的實(shí)驗(yàn)，因?yàn)樗鼤?huì)導(dǎo)致自由基的形成。

Tris和磷酸鹽都是很常用的緩沖液，它們有相同的地方也有很多不同的地方，如何能在使用時(shí)正確分辨和選擇，這也是難倒了一批人。我們今天就先從它們各自的應(yīng)用及使用環(huán)境講起。讓你能很直觀的感受到它們的區(qū)別。

Tris緩沖液

在電泳緩沖液中同甘氨酸構(gòu)成緩沖體系穩(wěn)定pH值；在凝膠中使用Tris-HCl緩沖體系穩(wěn)定pH值；被廣泛用作核酸和蛋白質(zhì)的溶劑；Tris緩沖液的低離子強(qiáng)度特點(diǎn)還可用于線蟲(chóng)的中間纖維的形成；在Tris鹽酸緩沖液中加入EDTA制成“TE緩沖液”，可用于DNA的穩(wěn)定和存儲(chǔ)；將調(diào)節(jié)pH值的酸溶液換成乙酸，獲得“TAE緩沖液”，換成硼酸可獲得TBE緩沖液。這兩種緩沖液常用于核酸電泳實(shí)驗(yàn)中。

磷酸鹽緩沖液

一般的有活性的生物制劑都要用磷酸鹽緩沖溶液來(lái)稀釋。原因就是它具有鹽平衡、可調(diào)整適宜pH值的緩沖作用。蒸餾水不具有鹽平衡作用，會(huì)破壞生物蛋白的結(jié)構(gòu)及生物特性；生理鹽水不具有調(diào)整pH的作用，對(duì)完整的、有活性的物質(zhì)不能保證其在最適條件下參與生物反應(yīng)，所以使用PBS是先選。當(dāng)然，有的生物活性物質(zhì)需要的條件比較高，就需要在平衡緩沖液中加入更多的成分，維持合適的條件保證生物活性物質(zhì)保持其最完整的特性。因此PBS主要用于細(xì)胞實(shí)驗(yàn)，其緩沖范圍最適宜在中性（7.0）。

在生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)中要慎重地選擇緩沖溶液，不僅要考慮緩沖液的緩沖范圍，還要綜合考慮緩沖液的使用環(huán)境：

1. 磷酸鹽緩沖溶液的緩沖范圍比較寬，但是它在pH7.5以上時(shí)緩沖能力很小；Tris本身呈堿性，可以只用Tris-HCl緩沖體系即可配制pH范圍由酸性到堿性的緩沖液，方法也較為簡(jiǎn)單，對(duì)于不同的實(shí)驗(yàn)，Tris還可以與其他物質(zhì)組成多種緩沖體系。

2. 磷酸鹽緩沖溶液易與常見(jiàn)的Ca2+離子、Mg2+離子以及重金屬離子締合生成沉淀，同時(shí)會(huì)抑zhi某些生物化學(xué)過(guò)程以及多數(shù)酶的活性，包括激酶，磷酸化酶，脫氫酶等；相比之下Tris緩沖溶液對(duì)生物化學(xué)過(guò)程干擾很小，也不與鈣、鎂離子及重金屬離子發(fā)生沉淀。若反應(yīng)體系中存在金屬離子或者酶制劑，則以Tris緩沖溶液為較優(yōu)選擇。

3. Tris緩沖液的pH值受溶液濃度影響較磷酸鹽緩沖溶液大，同樣稀釋十倍，磷酸鹽緩沖溶液的pH值變化小于0.1，而Tris緩沖液的pH值變化則大于0.1。因此對(duì)于體積變化較大的反應(yīng)體系，則應(yīng)慎重使用Tris 緩沖液。

4. 另外，Tris緩沖溶液受環(huán)境影響較大。一般來(lái)說(shuō)，溫度每升高一度，pH值下降0.03； 同時(shí)其易吸收空氣中的CO2，所以配制的緩沖液要蓋嚴(yán)密封。