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  37292519700317 2016-10-15 00:00:00

  測(cè)定CTL效應(yīng)的方法有：51鉻（Cr）釋放法和非同位素測(cè)定法兩大類。 　　一、經(jīng)典的CTL活性測(cè)定方法為51鉻（Cr）釋放法，本法結(jié)果準(zhǔn)確、重復(fù)性好，但也存在以下不足： 　　①使用放射性的51Cr不利于安全操作及廢物處置，且需特殊測(cè)定儀器； 　?、?1Cr自發(fā)釋放率高，常因不同靶細(xì)胞標(biāo)記效率變化差別大而影響結(jié)果判定； 　?、?1Cr半衰期（27.8天），無法用于需多次測(cè)定的動(dòng)物試驗(yàn)； 　?、芗?xì)胞共育時(shí)間短而試驗(yàn)操作步驟多，不能在單個(gè)細(xì)胞水平進(jìn)行測(cè)定。 　　二、非同位素測(cè)定法： 　　1 熒光測(cè)定法 　　1.1 alamarBlue一步熒光測(cè)定法 　　alamarBlue為活細(xì)胞代謝指示劑，易溶于水，進(jìn)入細(xì)胞后經(jīng)線粒體酶促還原產(chǎn)生熒光及顏色變化，可用以定量。具體測(cè)定方法是：在靶細(xì)胞孔（T）、效應(yīng)細(xì)胞孔（E）和實(shí)驗(yàn)孔（T+E）各加alamarBlue，共育6~24h后用板式熒光測(cè)定儀測(cè)530nm（發(fā)射）/590nm（散射）波長(zhǎng)熒光強(qiáng)度，將T及E孔熒光均值相加后減去實(shí)驗(yàn)孔（T+E）熒光均值，與T孔熒光均值比較即可計(jì)算CTL對(duì)靶細(xì)胞的溶解%。 　　1.2 Calcein-AM熒光掃描測(cè)定法 　　Calcein acetoxymethy1酯（Calcein-AM）是一種胞漿熒光標(biāo)記物，本身無熒光，滲入細(xì)胞后細(xì)胞內(nèi)酯酶催化生成的水溶性綠色熒光物質(zhì)不易透出細(xì)胞。靶細(xì)胞用其標(biāo)記后與效應(yīng)細(xì)胞共充，再加Fluoro-Quench試劑（一種以Ca2+螯合的小牛血紅蛋白主要成分、還含溴化乙啶試劑，它對(duì)細(xì)胞無毒，不能進(jìn)入活細(xì)胞但可能進(jìn)入膜已破損的死細(xì)胞），淬滅培養(yǎng)液中的熒光，在板式熒光掃描儀上定量測(cè)定活細(xì)胞內(nèi)的熒光強(qiáng)度，與靶細(xì)胞對(duì)照孔（代表細(xì)胞存活）比較。即可計(jì)算效應(yīng)細(xì)胞殺傷靶細(xì)胞%。 　　2 流式細(xì)胞分析法 　　2.1 PE-mAb/FITC-annexin V 熒光標(biāo)記法 　　正常細(xì)胞的磷酯酰絲氨（phosphatidylserine，PS）位于細(xì)胞膜內(nèi)表面，細(xì)胞凋亡(Apoptosis)時(shí)翻轉(zhuǎn)露于膜外側(cè)，可與annexinV高親合力結(jié)合。研究發(fā)現(xiàn)PS外翻為細(xì)胞凋亡(Apoptosis)的早期事件，先于膜通透性增加所51Cr或其他染料的釋放。將效應(yīng)細(xì)胞與靶細(xì)胞充分共育后，用PE結(jié)合的效應(yīng)細(xì)胞特異性單克隆抗體（如CD8-PE）標(biāo)記效應(yīng)細(xì)胞（不能與PE-mABA結(jié)合的細(xì)胞即為靶細(xì)胞），再用FITC-annexin V標(biāo)記凋亡靶細(xì)胞，用流式細(xì)胞儀區(qū)分并定量此三類不同的細(xì)胞群，即可計(jì)算出效應(yīng)細(xì)胞殺傷靶細(xì)胞%。 　　2.2 DIOC18(3)/碘化丙錠（PI）熒光標(biāo)記法 　　用DIOC18（3）（3，3，-dioctadecyloxacarbocyanine perchlorate）標(biāo)記靶細(xì)胞膜，用紅色熒光核染料PI（propidium iodide）標(biāo)記效應(yīng)細(xì)胞和死亡靶細(xì)胞，通過流式細(xì)胞分析可清楚區(qū)分2類細(xì)胞。在用人和豬的外周血單核細(xì)胞（PBMC）作效應(yīng)細(xì)胞時(shí)可觀察到靶細(xì)胞溶解%與不同E：T比之間存在良好相關(guān)。本法簡(jiǎn)單易行，與51Cr釋放法同樣敏感可信，重復(fù)性和相關(guān)性很好，另一優(yōu)點(diǎn)是可用新制備的脾細(xì)胞作靶細(xì)胞，不再需要培養(yǎng)及活化靶細(xì)胞，還可測(cè)多種動(dòng)物的NK活性。 　　2.3 PKH-26/CFSE熒光標(biāo)記法 　　Sheehy等采用PKH26和CFSE雙示法可有效記和區(qū)分靶細(xì)胞，其標(biāo)記靶細(xì)胞后的自發(fā)釋放僅為51Cr釋放法的1/40，因此可更準(zhǔn)確地評(píng)價(jià)及檢測(cè)少量CTL介導(dǎo)的細(xì)胞溶解。平行試驗(yàn)結(jié)是顯示本法與51Cr釋放法明顯相關(guān)（r2=0.998，p<0.0001），對(duì)進(jìn)一步研究效應(yīng)細(xì)胞溶解細(xì)胞的機(jī)理具有應(yīng)用價(jià)值。 　　2.3 樹突狀細(xì)胞（DC）清除法 　　抗原標(biāo)記的樹突狀細(xì)胞DC(dendritic cell)在體內(nèi)的存活與CTL活性明顯相關(guān)。將DC用兩種不同熒光物質(zhì)標(biāo)記，再分為兩部分，一部分用抗原標(biāo)記，另一部分不標(biāo)記，二者混合后注入小鼠皮下，只有標(biāo)記了特異抗原的DC自引流淋巴結(jié)清除，未標(biāo)記抗原的DC仍存于局部不受影響。據(jù)此建立了簡(jiǎn)單靈敏體內(nèi)測(cè)定CTL活性的方法。由于DC可有效攝取及呈遞復(fù)合抗原、核酸及凋亡小體，本法除可測(cè)定用特異性肽負(fù)荷的DC免疫或用流感病毒感染所產(chǎn)生的CTL反應(yīng)外，也可用于評(píng)價(jià)不具有肽表位特征的抗原的CTL活性。 　　3.報(bào)告基因轉(zhuǎn)染法 　　應(yīng)用基因轉(zhuǎn)染技術(shù)將原核或真核生物的報(bào)告酶如β-半孔糖苷酶（β-galactosidase，β-gal）或熒光素酶（luciferase，luc）基因轉(zhuǎn)染靶細(xì)胞，建立穩(wěn)定轉(zhuǎn)染靶細(xì)胞系，以此測(cè)定CTL、NK細(xì)胞及藥物介導(dǎo)的細(xì)胞毒和細(xì)胞凋亡(Apoptosis)。通過測(cè)定釋放入培養(yǎng)液中報(bào)告酶活性（代表靶細(xì)胞死亡數(shù)目），可以計(jì)算效應(yīng)細(xì)胞殺傷靶細(xì)胞%。其中β-gal半衰期較luc長(zhǎng)，應(yīng)用較為方便。 　　4 比色測(cè)定法 　　4.1 MTT（或MTS）還原法 　　本法根據(jù)細(xì)胞代謝活動(dòng)與活細(xì)胞數(shù)直接成比例的原理，通過測(cè)定靶細(xì)胞代謝活性的減少來反映效應(yīng)細(xì)胞所致靶細(xì)胞的死亡。氧化型MTT進(jìn)入細(xì)胞后被線粒體脫氫酶還原生成藍(lán)色formazan顆粒，經(jīng)溶劑溶解后比色定量，其顏色深淺直接與活細(xì)胞數(shù)有關(guān)，與靶細(xì)胞對(duì)照孔比較可計(jì)算效應(yīng)細(xì)胞殺傷靶細(xì)胞%。 　　4.2 LDH釋放法 　　酸脫氫酶（LDH）在胞漿內(nèi)含量豐富，正常時(shí)不能通過細(xì)胞膜，當(dāng)細(xì)胞受損傷或死亡時(shí)可釋放到細(xì)胞外，此時(shí)細(xì)胞培養(yǎng)液中LDH活性與細(xì)胞死亡數(shù)目成正比，用比色法測(cè)定并與靶細(xì)胞對(duì)照孔LDH活性比較，可計(jì)算效應(yīng)細(xì)胞對(duì)靶細(xì)胞的殺傷%。 　　5 其他 　　5.1 “雞尾酒“混合刺激法 　　將外周血細(xì)胞在體外用一種含有抗原、細(xì)胞因子、共刺激分子及放射照射的飼養(yǎng)細(xì)胞的混合“雞尾酒”刺激7天后，在有限稀釋條件下可從微孔板快速測(cè)得抗原特異性信號(hào)。本法靈敏性高，較傳統(tǒng)的CTL測(cè)定方法更有效，尤其是本法僅需150μl小鼠外周血而無需處死動(dòng)物，因此可增加每次測(cè)定時(shí)的小鼠數(shù)量，還可在體內(nèi)研究過程中于不同時(shí)間從每個(gè)小鼠多次取血測(cè)定，大大方便了CTL反應(yīng)及其體內(nèi)效果的相關(guān)性研究。 　　5.2 ELISPOT試驗(yàn) 　　酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)試驗(yàn)（ELISPOT）通過檢測(cè)抗原誘導(dǎo)的細(xì)胞因子（如IFN-γ）的分泌，可在體外定量測(cè)定病人PBMC中抗原特異性T細(xì)胞反應(yīng)(T細(xì)胞受抗原刺激產(chǎn)生并釋放IFN-γ)。本法在肽特異性分泌IFN-γ的T細(xì)胞數(shù)量與細(xì)胞毒活性之間，與標(biāo)準(zhǔn)的51Cr釋放法相關(guān)良好，是一種在臨床試驗(yàn)中監(jiān)測(cè)病人對(duì)腫瘤抗原的CTL或Th-細(xì)胞反應(yīng)的靈敏、準(zhǔn)確、價(jià)廉、的方法，可對(duì)腫瘤病人的抗腫瘤疫苗(vaccine)療法的優(yōu)化提供必要的信息。 　　以上幾種CTL測(cè)定方法各有特點(diǎn)，其中隨著熒光測(cè)定儀器的普及和新的熒光標(biāo)記物的發(fā)現(xiàn)，熒光測(cè)定法將有可能取代傳統(tǒng)的51Cr釋放法，而微量和直接測(cè)定體內(nèi)CTL活性的方法將為細(xì)胞免疫研究開辟新路。

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