很常見(jiàn)的場(chǎng)景如下：

細(xì)胞轉(zhuǎn)染后，想用流式檢測(cè)表達(dá)GFP細(xì)胞的百分比并且分選，但是不同的設(shè)門(mén)方法讓GFP陽(yáng)性細(xì)胞百分比看起來(lái)有差異，究竟下面哪種策略才適合呢？

今天我們主要討論一下FSC和SSC上設(shè)門(mén)對(duì)GFP陽(yáng)性細(xì)胞百分比的影響。讓我們一個(gè)一個(gè)設(shè)門(mén)，把每種情況具體看一下。

保持FITC通道上的門(mén)不變，我們來(lái)看一下在前向和側(cè)向的散點(diǎn)圖上設(shè)門(mén)在不同的位置，代表你選擇了什么類型的細(xì)胞。只有P1賦予了藍(lán)色，其他門(mén)的顏色去掉，這樣，我們就可以很方便的看出來(lái)細(xì)胞群在不同的圖上所處的位置。

第 一種設(shè)門(mén)，除了左下角靠近0的碎片不圈，其他基本都圈上，從第二張SSC-A和SSC-H排粘連的散點(diǎn)圖可以看出來(lái)有單個(gè)細(xì)胞也有粘連細(xì)胞，P2門(mén)下 GFP陽(yáng)性細(xì)胞百分比為61.36%。

第二種設(shè)門(mén)，只圈最密集的這一群，從第二張SSC-A和SSC-H排粘連的散點(diǎn)圖可以看出來(lái)，這部分的細(xì)胞基本都是單個(gè)的，P2門(mén)下 GFP陽(yáng)性細(xì)胞百分比為65.39%，較第 一種高。

第三種設(shè)門(mén)，密集細(xì)胞群左邊的和左下角靠近0的碎片不圈，只圈右邊的這兩群，從第二張SSC-A和SSC-H排粘連的散點(diǎn)圖可以看出來(lái)有單個(gè)細(xì)胞也有粘連細(xì)胞，P2門(mén)下 GFP陽(yáng)性細(xì)胞百分比為65.70%，較第 一種高，和第二種差不多，但是稍微高一點(diǎn)。

這樣分析下來(lái)，大家最 大的困惑是這三群細(xì)胞要不要圈，怎么圈才是最 好的？讓我們?cè)诘?一張F(tuán)SC和SSC的散點(diǎn)圖上根據(jù)細(xì)胞群設(shè)三個(gè)門(mén)。

三個(gè)門(mén)分別為P1、P4和P5，顯示了三種不同的細(xì)胞群。

P1顯示為單個(gè)細(xì)胞，F(xiàn)ITC通道上陽(yáng)性細(xì)胞比例為65.54%。

P4顯示大部分為粘連的細(xì)胞，因此在FITC通道上的陽(yáng)性細(xì)胞比例為71.43%，較P1細(xì)胞群高，如果分析時(shí)加入這群細(xì)胞會(huì)增加GFP陽(yáng)性細(xì)胞百分比。如果在單克隆分選中選擇這群，會(huì)導(dǎo)致雖然篩選到陽(yáng)性細(xì)胞，但是單克隆源性降低。

P5顯示為單個(gè)細(xì)胞，但是因?yàn)镕SC較P1小，考慮是細(xì)胞狀態(tài)不好細(xì)胞呈現(xiàn)皺縮導(dǎo)致，所以其在FITC通道上的陽(yáng)性細(xì)胞比例為20.15%，較P1細(xì)胞群低的多，如果分析時(shí)加入這群細(xì)胞則會(huì)降低GFP陽(yáng)性細(xì)胞百分比。如果加入7AAD染料，這群會(huì)呈現(xiàn)出陽(yáng)性，所以在分選中這群細(xì)胞不該圈選，或者在去除死細(xì)胞的門(mén)中去除。

由此可見(jiàn)，如果只想要分析狀態(tài)好的單個(gè)細(xì)胞的GFP陽(yáng)性百分比，那你可以選擇P1門(mén)的設(shè)門(mén)方式，當(dāng)然也可以把P1和P4都選上，再用SSC-A和SSC-H去掉粘連細(xì)胞對(duì)數(shù)據(jù)的干擾。

練習(xí)題

如果您在細(xì)胞轉(zhuǎn)染后，流式檢測(cè)表達(dá)mCherry細(xì)胞的百分比時(shí)發(fā)現(xiàn)，mCherry通道細(xì)胞群并沒(méi)有呈現(xiàn)明顯分開(kāi)的兩群（由于細(xì)胞在mCherry通道有較高的自發(fā)熒光），要怎么確定mCherry細(xì)胞百分比并且分選呢？