關(guān)于實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)，最常見的應(yīng)用是通過RT-qPCR進(jìn)行基因表達(dá)分析、疾病診斷和管理（如病毒定量）、食品檢測(cè)（如轉(zhuǎn)基因或過敏原分析）以及動(dòng)物或植物育種等研究。這種方法非常靈敏，因此為了得到可靠的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，避免錯(cuò)誤是十分重要的。RT和qPCR數(shù)據(jù)評(píng)估的整個(gè)工作流程包括以下幾點(diǎn)：

1、實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

2、樣品的制備和提取/純化

3、RT和qPCR

4、數(shù)據(jù)評(píng)估

在以上過程中，實(shí)驗(yàn)人員有可能因?yàn)椴僮麇e(cuò)誤或失誤導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的失真。但往往有些錯(cuò)誤的來源又十分不明確，所以排除故障的第一步是需要再次檢查實(shí)驗(yàn)流程并重復(fù)實(shí)驗(yàn)。

實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

RT或qPCR反應(yīng)的第一個(gè)重要步驟是測(cè)定PCR產(chǎn)物及驗(yàn)證相應(yīng)的引物和探針。實(shí)時(shí)RT-qPCR引物和探針最有效的設(shè)計(jì)是使用引物設(shè)計(jì)軟件，大多數(shù)軟件都可以調(diào)整設(shè)置參數(shù)的最佳屬性，以檢索到符合要求的引物探針序列。這些設(shè)置參數(shù)考慮熔化溫度Tm、互補(bǔ)性、二級(jí)結(jié)構(gòu)以及擴(kuò)增子大小和其他重要因素。同時(shí)建議跨內(nèi)含子設(shè)計(jì)引物，避免來自gDNA的干擾，直接得到cDNA片段。對(duì)于基因特異性引物的設(shè)計(jì)，應(yīng)滿足以下標(biāo)準(zhǔn)：

擴(kuò)增子大小: 75-200 bp

引物長(zhǎng)度: 18-30 bp

GC 含量: 40-60%

解鏈溫度: 55-60℃

3' 端: 1-2 G or C，以具有良好的穩(wěn)定性

不超過3個(gè)G or C （可能不匹配）

沒有二級(jí)結(jié)構(gòu)，重復(fù)序列或回文結(jié)構(gòu)

濃度: 150-200 nM

樣品的制備和提取/純化

模板的質(zhì)量直接影響到檢測(cè)性能，在qPCR結(jié)果的故障排除過程中也需要考慮。首先，組織取樣和保存是實(shí)驗(yàn)可變性的第一個(gè)潛在來源。對(duì)于基因的定量，必須使用高質(zhì)量的RNA，這意味著需要非常仔細(xì)地檢查RNA的濃度和質(zhì)量。

降解或不純的RNA會(huì)限制逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)的效率，降低產(chǎn)量；部分降解的RNA可能不能給出準(zhǔn)確的基因表達(dá)結(jié)果。核酸應(yīng)從新鮮或立即冷凍的組織中提取和純化；同時(shí)建議使用生物學(xué)重復(fù)（至少3個(gè)）。RNA或DNA的分離是PCR實(shí)驗(yàn)前的關(guān)鍵步驟。這是必要的，以便提取對(duì)所有樣本都是有效的，并得到純化的核酸（DNA，RNA）?？刹捎酶叻直媛虱傊悄z檢測(cè)核酸質(zhì)量和分光光度法（A260/A280=1.8和A260/A230=2.0）檢測(cè)核酸純度。

另外也要注意，用于PCR制備的工作空間所有臺(tái)面及物品都應(yīng)進(jìn)行常規(guī)去污，以防止交叉污染。

逆轉(zhuǎn)錄和實(shí)時(shí)熒光定量PCR

RT-qPCR是一種分析DNA或RNA的高靈敏性工具。當(dāng)PCR擴(kuò)增靶標(biāo)時(shí)，錯(cuò)誤同時(shí)被放大?？梢酝ㄟ^標(biāo)準(zhǔn)化和盡量減少移液步驟來減少PCR反應(yīng)中的技術(shù)錯(cuò)誤；在無灰塵的干凈環(huán)境中建立反應(yīng)；通過對(duì)無模板（水）對(duì)照進(jìn)行PCR反應(yīng)，常規(guī)檢查引物和試劑庫存的DNA污染等。

在進(jìn)行qPCR時(shí)可能會(huì)出現(xiàn)以下故障：沒有擴(kuò)增、qPCR效率多大或過小、Cq值過大、重復(fù)性差、擴(kuò)增曲線異常、非特異性擴(kuò)增等等。

運(yùn)行后的數(shù)據(jù)分析-基線和閾值的設(shè)置

基線校正是去除背景熒光的必要條件?？赡艿脑蚴莙PCR設(shè)備的檢測(cè)器噪音，或是不同的樣品量或染料（探針或插入染料）的殘留熒光。所有樣本的基線起點(diǎn)一般從0~3個(gè)循環(huán)開始進(jìn)行量化，基線終點(diǎn)是在各個(gè)擴(kuò)增曲線起峰位置前的1~2個(gè)循環(huán)。為了使實(shí)時(shí)RT-qPCR數(shù)據(jù)有意義，應(yīng)在擴(kuò)增曲線的指數(shù)擴(kuò)增階段設(shè)置閾值，閾值自動(dòng)設(shè)置一般是基線期熒光信號(hào)標(biāo)準(zhǔn)偏差的10倍。

Cielo?實(shí)時(shí)熒光定量PCR系統(tǒng)

Cielo?實(shí)時(shí)熒光定量PCR系統(tǒng)可為您提供3/6檢測(cè)通道，根據(jù)實(shí)驗(yàn)需求靈活配置。這款產(chǎn)品采用高能LED作為光源系統(tǒng)，可保證光源強(qiáng)度高，光源一致性好；高品質(zhì)的帕爾貼溫度模塊作為溫控系統(tǒng)，升降溫速率快，可設(shè)置12列跨度30°C的溫度梯度；CMOS拍照+光纖信號(hào)傳輸作為檢測(cè)系統(tǒng)，CMOS檢測(cè)靈敏度高，光纖傳輸速度快，無光損失和噪音干擾，無需ROX校準(zhǔn)。Cielo?實(shí)時(shí)熒光定量PCR系統(tǒng)可為您的科學(xué)研究提供高精準(zhǔn)度、高靈敏度和高可靠性的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

前言

聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）是用于擴(kuò)增特定DNA片段的分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)。實(shí)時(shí)熒光定量PCR（以下簡(jiǎn)稱qPCR）作為第二代PCR技術(shù)，自1996年推出以來，已經(jīng)廣泛應(yīng)用于基因表達(dá)分析、病原微生物檢測(cè)、動(dòng)植物育種等許多研究領(lǐng)域，為了獲得最理想的檢測(cè)結(jié)果，qPCR從樣本采集、核酸提取、cDNA合成到上機(jī)檢測(cè)的流程有許多可以優(yōu)化的參數(shù)。

qPCR實(shí)驗(yàn)的工作流程首先需要確定研究的目的，根據(jù)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)規(guī)劃好實(shí)驗(yàn)分組、重復(fù)次數(shù)等細(xì)節(jié)。接下來分為樣本準(zhǔn)備和引物探針驗(yàn)證兩個(gè)重要的步驟。樣本準(zhǔn)備主要是核酸提取逆轉(zhuǎn)錄等步驟，引物探針需要去測(cè)試特異性和效率。接下來需要使用qPCR儀來對(duì)樣品中的目的核酸進(jìn)行擴(kuò)增qPCR結(jié)束后根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康膶?duì)目的核酸進(jìn)行相對(duì)或者絕對(duì)定量。接下來講的qPCR體系優(yōu)化會(huì)圍繞著這個(gè)流程展開。

1.樣本的采集與處理

首先，提前做好功課，了解樣本的不同分型，或者了解詳細(xì)的細(xì)胞分群。如果條件允許盡可能覆蓋所有的組織類型或者細(xì)胞類型。其次，盡可能增加樣本數(shù)量，也就是生物學(xué)重復(fù)，從而更客觀地反映生物變異程度。另外，qPCR實(shí)驗(yàn)也需要有技術(shù)重復(fù)來降低誤差。

采樣是需要嚴(yán)格規(guī)劃的過程，比如材料的時(shí)效性、珍貴程度等，都要納入考量范圍。樣品要盡量新鮮，取樣盡可能快速。戴手套操作，防止污染。如果不馬上提取核酸，需要-80°C保存，并盡快處理。

2.核酸的提取和檢測(cè)

模板的質(zhì)量直接影響到檢測(cè)性能。核酸提取需要有效地將RNA或DNA從其他混合物中分離。RNA樣本中的污染物——基因組DNA、DNA結(jié)合蛋白、酚類化合物或在提取RNA過程中引入的外源雜質(zhì)(如手套中的粉末)——都已被證明會(huì)抑制下游實(shí)驗(yàn)，如逆轉(zhuǎn)錄和PCR擴(kuò)增。核酸提取需要使用無菌無酶的試劑耗材，避免RNase或DNase污染，并對(duì)內(nèi)源RNAse或DNAse進(jìn)行有效抑制；多糖多酚樣品要考慮多糖多酚雜質(zhì)的有效去除。低溫保存防止RNA或DNA降解。

降解或不純的RNA會(huì)限制逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)的效率，降低產(chǎn)量。部分降解的RNA可能不能給出準(zhǔn)確的基因表達(dá)結(jié)果。對(duì)于基因的定量，必須使用高質(zhì)量的RNA，這意味著需要非常仔細(xì)地檢查RNA的濃度和質(zhì)量?？刹捎酶叻直媛虱傊悄z檢測(cè)核酸質(zhì)量和分光光度法（A260/A280=1.8和A260/A230=2.0）檢測(cè)核酸純度和濃度。

3.cDNA合成

RNA 質(zhì)量對(duì) cDNA 合成結(jié)果會(huì)產(chǎn)生重要影響。并且RNA 很脆弱，容易降解。為了保證 RNA 的完整性，我們需要非常注意，比如在冰上操作，用 RNase-free 的槍頭和離心管，減少操作時(shí)間等。在反應(yīng)體系中加入 RNase 抑制劑也能有效防止 RNA 降解。

如何評(píng)價(jià)樣品中的雜質(zhì)對(duì)逆轉(zhuǎn)錄的影響呢？可以梯度稀釋后繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，如果低濃度的樣品點(diǎn)數(shù)值偏大比較明顯，基本可以判定雜質(zhì)影響顯著。

不同廠家的反轉(zhuǎn)錄試劑會(huì)有差異，對(duì)RNA中的雜質(zhì)耐受程度也不同。逆轉(zhuǎn)錄酶在整個(gè)反轉(zhuǎn)錄體系中具有關(guān)鍵性影響。除了活性以外，逆轉(zhuǎn)錄酶的熱穩(wěn)定性同樣很重要，在較高溫度下進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，能夠減少 RNA 的二級(jí)結(jié)構(gòu)，增加逆轉(zhuǎn)錄的效率。

除了掌握 RNA 的完整性之外，反轉(zhuǎn)錄之前還需要對(duì) RNA 濃度進(jìn)行測(cè)定。一般反轉(zhuǎn)錄試劑盒會(huì)對(duì)上樣量有要求，建議 total RNA 上樣量小于 5 μg。超過這個(gè)范圍，會(huì)使反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物產(chǎn)生偏好性 (表達(dá)豐度高的基因優(yōu)先被反轉(zhuǎn)錄) 而造成定量結(jié)果不準(zhǔn)確。

逆轉(zhuǎn)錄出來的cDNA可以直接放在4°C保存，若長(zhǎng)期不用，可分裝，然后-20°C保存。

4.qPCR方法的建立

① 定量方法

絕對(duì)定量：檢測(cè)起始模板數(shù)的精確拷貝數(shù)，需要標(biāo)準(zhǔn)品構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)曲線。

標(biāo)準(zhǔn)品可以是純化的基因組DNA、質(zhì)粒DNA或者體外轉(zhuǎn)錄RNA(cDNA)，其作用是生成標(biāo)準(zhǔn)曲線，建立Ct值與濃度之間的線性關(guān)系。

標(biāo)準(zhǔn)品與待測(cè)樣品的PCR效率一致，且接近100%，與樣品的性質(zhì)盡可能接近，與樣品相同的擴(kuò)增條件（PCR體系、耗材、同一次擴(kuò)增），大于或等于5個(gè)梯度稀釋的標(biāo)準(zhǔn)品。

相對(duì)定量：在一個(gè)樣本中，目的基因相對(duì)于內(nèi)參基因的量的變化。

內(nèi)參基因選擇建議篩選不少于三個(gè)內(nèi)參基因來歸一化RT-qPCR數(shù)據(jù)。目的是消除外部樣品偏差，例如總RNA含量，RNA穩(wěn)定性，酶效率或樣品裝載量的變化。

對(duì)候選的內(nèi)參基因進(jìn)行qPCR 實(shí)驗(yàn)，得出Ct平均值以及 Ct值的標(biāo)準(zhǔn)偏差，選擇SD最小的基因作為實(shí)驗(yàn)內(nèi)參?？赏ㄟ^geNorm 、 BestKeeper  、 NormFinder、RefGenes 等工具來評(píng)估您的內(nèi)參基因。

② 熒光標(biāo)記方法

染料法：利用能與DNA雙鏈結(jié)合的染料來實(shí)現(xiàn)，如SYBR Green I。該染料在游離狀態(tài)下呈現(xiàn)微弱的熒光，一旦與雙鏈DNA的雙螺旋小溝結(jié)合，其綠色熒光增強(qiáng)約1000倍。因此其總的熒光強(qiáng)度與雙鏈DNA含量成正比，利用這一關(guān)系可以反映生成的PCR產(chǎn)物的量。

TaqMan熒光探針：是一種寡核苷酸探針，熒光基團(tuán)連接在探針的5'末端，而淬滅劑則在3'末端。PCR擴(kuò)增時(shí)在加入一對(duì)引物的同時(shí)加入一個(gè)特異性的熒光探針，探針完整時(shí)，報(bào)告基團(tuán)發(fā)射的熒光信號(hào)被淬滅基團(tuán)吸收; PCR擴(kuò)增時(shí), Tag酶的5'-3'外切酶活性將探針酶切降解，使報(bào)告熒光基團(tuán)和淬滅熒光基團(tuán)分離，從而熒光監(jiān)測(cè)系統(tǒng)可接收到熒光信號(hào)，每擴(kuò)增一條DNA鏈，就有一個(gè)熒光分子形成,實(shí)現(xiàn)了熒光信號(hào)的累積與PCR產(chǎn)物形成完全同步。常用的熒光基團(tuán)是FAM，TET，VIC，HEX。

引物探針設(shè)計(jì)可以參考Gene π網(wǎng)站.

③  引物擴(kuò)增效率驗(yàn)證

標(biāo)準(zhǔn)曲線是評(píng)估PCR擴(kuò)增效率最可靠和穩(wěn)定的一種方法，該方法涉及到制作一系列的樣品來控制目標(biāo)模板的相對(duì)數(shù)量。最常用的是10倍梯度稀釋樣品，采用標(biāo)準(zhǔn)qPCR程序進(jìn)行擴(kuò)增獲得Cq值，最后根據(jù)各樣品濃度及相應(yīng)的Cq值繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到線性方程Cq= -klgX0+b，擴(kuò)增效率E=10(-1/k)-1。利用qPCR進(jìn)行定量分析時(shí)，要求擴(kuò)增效率范圍在90%-110%（3.6＞k＞3.1）。

④  反應(yīng)體系優(yōu)化

?  根據(jù)儀器類型，選擇合適的耗材和qPCR試劑。

? 每對(duì)引物先進(jìn)行預(yù)實(shí)驗(yàn)，確定特異性以及最適濃度。

?  配置不同的PCR反應(yīng)體系，選擇每個(gè)組分合適的濃度。

?  設(shè)置溫度梯度測(cè)試引物最合適的退火溫度。

?  實(shí)驗(yàn)設(shè)置NTC、NRT、 NEG和POS等對(duì)照組，來監(jiān)控實(shí)驗(yàn)體系或污染。

實(shí)時(shí)熒光定量PCR常見問題分析

1.可疑的擴(kuò)增曲線

真正的擴(kuò)增曲線，有特征的形狀：首先背景信號(hào)，然后是三個(gè)增長(zhǎng)階段（指數(shù)增長(zhǎng)期、線性增長(zhǎng)期和平臺(tái)期）。

如果不是同時(shí)具有特征性的三個(gè)增長(zhǎng)階段，沒有典型的指數(shù)增長(zhǎng)期，那就不存在擴(kuò)增。

平臺(tái)期很低也是常見的異常擴(kuò)增曲線。可能是模板的濃度太低。通常如果模板的起始濃度太低, 反應(yīng)體系中會(huì)形成大量的引物二聚體。大量引物二聚體的形成使得引物很快消耗完，從而造成擴(kuò)增曲線的平臺(tái)期很低。這種情況可通過調(diào)整引物和模板的比例。

2.異常的熒光信號(hào)

NTC出現(xiàn)熒光信號(hào)---引物二聚體形成或氣溶膠污染，查看熔解曲線是否為單一峰。

3.擴(kuò)增效率過高或過低

過低的擴(kuò)增效率（<90％）可能存在的原因：

?  移液器校準(zhǔn)不良或移液技術(shù)差。

? 不正確的稀釋導(dǎo)致標(biāo)準(zhǔn)曲線出現(xiàn)錯(cuò)誤。

?  引物設(shè)計(jì)不好或擴(kuò)增子具有二級(jí)結(jié)構(gòu)。

?  標(biāo)準(zhǔn)曲線動(dòng)態(tài)范圍太小。

?  Taq酶無活性或活性降低。

?  樣品抑制。

過高的擴(kuò)增效率（> 110％）可能存在的原因：

?  移液器校準(zhǔn)不良或移液技術(shù)差。

? 不正確的稀釋導(dǎo)致標(biāo)準(zhǔn)曲線出現(xiàn)錯(cuò)誤。

?  引物二聚體或非特異性擴(kuò)增。

?  標(biāo)準(zhǔn)曲線動(dòng)態(tài)范圍太小。

?  基因組DNA污染。

4.重復(fù)性差

為精確定量，對(duì)每個(gè)樣品都要做重復(fù)實(shí)驗(yàn)，復(fù)孔之間的Ct值不應(yīng)超過0.5，標(biāo)準(zhǔn)偏差不大于0.2，這樣，實(shí)驗(yàn)結(jié)果就有很好的精確度。

造成重復(fù)性差的原因：

?  加樣誤差（操作或者加樣器導(dǎo)致）。

? 沒有將試劑和樣品充分混勻。

?  低拷貝的目的片段→泊松分布。

?  基線閾值設(shè)定不合理。

Cielo?實(shí)時(shí)熒光定量PCR系統(tǒng)

Harness of the power of qPCR

?   數(shù)據(jù)可靠性：連續(xù)1000次實(shí)驗(yàn)后，結(jié)果高度一致。

?  應(yīng)用靈活性：提供多種qPCR應(yīng)用分析。

?   流程智能化：中英文用戶界面，觸控操作，可多機(jī)聯(lián)用。

?   在線便捷性：主機(jī)可獨(dú)立運(yùn)行qPCR程序，數(shù)據(jù)可USB、Wi-Fi等網(wǎng)絡(luò)傳輸。