作為構(gòu)成神經(jīng)系統(tǒng)的基本結(jié)構(gòu)和功能單位，神經(jīng)細(xì)胞的體外分離、培養(yǎng)在神經(jīng)科學(xué)研究中占據(jù)前沿地位。由于神經(jīng)元分離后不會(huì)再次分裂、增殖，因此在進(jìn)行相關(guān)細(xì)胞實(shí)驗(yàn)時(shí)，需要高效地制備高質(zhì)量原代神經(jīng)細(xì)胞保證實(shí)驗(yàn)材料的供應(yīng)。

然而神經(jīng)細(xì)胞的分離制備難度較大，相較于新生鼠，成年鼠腦的解離更復(fù)雜，需要機(jī)械和酶解聯(lián)合作用來降解細(xì)胞外基質(zhì)，同時(shí)大量的髓鞘碎片和紅細(xì)胞也會(huì)干擾下游實(shí)驗(yàn)。

那么，如何快速制備高質(zhì)量的大/小鼠神經(jīng)細(xì)胞懸液樣本呢？接下來，我們從實(shí)驗(yàn)儀器及材料、實(shí)驗(yàn)步驟和實(shí)驗(yàn)結(jié)果一一介紹，希望對你的實(shí)驗(yàn)有所幫助。

實(shí)驗(yàn)儀器及材料

瑞沃德 DSC-400單細(xì)胞懸液制備儀；

瑞沃德 HJ-400 加熱套；

瑞沃德 DHABE-5003大小鼠成年腦組織溫和酶解試劑盒；

瑞沃德 SCT-100組織處理管；

70μm 細(xì)胞濾器；

瑞沃德眼科手術(shù)器械；

細(xì)胞培養(yǎng)耗材、移液槍等。

實(shí)驗(yàn)步驟

1、按照說明書要求，混合配置酶mix并37℃水浴激活。

2、剝離成年鼠（P>7）腦組織，暫存至盛有HBSS（含Ca2+和Mg2+）的培養(yǎng)皿中，用眼科鑷輕輕地將腦組織的血管盡可能去除。

盡可能剔除腦組織上的血管

3、將腦組織和酶mix放于組織處理管中，用剪刀將全腦簡單剪成4塊。

4、將組織處理管倒置至單細(xì)胞懸液制備儀上，安裝加熱套，運(yùn)行程序 M_ABrain_Heater_2。

5、潤濕細(xì)胞濾器，過濾細(xì)胞懸液樣本，300×g ，離心10 min。

使用細(xì)胞篩過濾雜質(zhì)

6、轉(zhuǎn)移細(xì)胞樣本至15mL離心管，加入去碎片試劑后混勻，上層鋪預(yù)冷的PBS，3000×g， 4℃，升速為5，降速為3，離心10min，保留下層細(xì)胞后洗滌收集。

去除碎片，收集下層細(xì)胞

7、裂紅操作（可選）。

8、細(xì)胞計(jì)數(shù)及流式檢測。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果

使用瑞沃德單細(xì)胞懸液制備儀處理成年小鼠腦組織獲得的細(xì)胞可達(dá)90%，細(xì)胞活性高，不影響下游實(shí)驗(yàn)。瑞沃德 DHABE-5003大小鼠成年腦組織溫和酶解試劑盒，可用于成年大鼠或小鼠(P>7)全腦組織的單細(xì)胞懸液制備，可支持腦內(nèi)所有神經(jīng)及非神經(jīng)細(xì)胞的分離。

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免費(fèi)申請?jiān)囉脝渭?xì)胞懸液制備儀

原代細(xì)胞 (primary cell) 是指從機(jī)體的組織（如人體組織、小鼠組織等）經(jīng)特定方法獲得單個(gè)細(xì)胞，并在體外進(jìn)行模擬機(jī)體培養(yǎng)的細(xì)胞。原代細(xì)胞離體時(shí)間較短，生物學(xué)特性未發(fā)生較大變化，仍保有機(jī)體組織的遺傳特征，能更好地反映細(xì)胞在體內(nèi)的生長狀態(tài)，因此可獲得與體內(nèi)生理功能更接近的數(shù)據(jù)，更適合用于藥物測試、細(xì)胞分化和轉(zhuǎn)化等實(shí)驗(yàn)研究。

原代細(xì)胞分離是指使用酶、螯合劑（常用EDTA）以及機(jī)械方法處理動(dòng)物組織，使其分散為單細(xì)胞懸液樣品，后續(xù)在適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)體系下使分離的原代細(xì)胞進(jìn)行生存、生長和繁殖的過程。針對不同物種的不同組織類型，其具體的操作流程也要進(jìn)行調(diào)整，常規(guī)原代細(xì)胞分離流程為取樣→預(yù)處理→分離處理→過濾清洗→后處理。

01

取樣→預(yù)處理

取樣是原代單細(xì)胞懸液制備非常重要的一步，其質(zhì)量會(huì)直接影響到后續(xù)處理效果。

操作時(shí)，首先根據(jù)不同實(shí)驗(yàn)需求麻醉或處死動(dòng)物后進(jìn)行消毒、固定并切開相應(yīng)位置皮膚暴露目的組織。

（▲暴露目的組織）

同時(shí)不同組織類型，取樣時(shí)也有細(xì)微差別。

其次操作過程中有以下幾點(diǎn)也需要注意：

• 嚴(yán)格無菌操作，快速處理；

• 針對不同組織類型控制環(huán)境溫度；

• 保證工具鋒利，減少機(jī)械損傷，動(dòng)作輕柔，保持組織濕潤；

• 盡量去除非相關(guān)組織，尤其是殘留的小血管等；

• 完整記錄組織情況、重量等信息。

拿到樣本后針對不同分離流程選擇不同的預(yù)處理方式（如將腫瘤組織剪切到2-4mm左右的小塊），如血液細(xì)胞等已經(jīng)是單細(xì)胞懸液的樣本在簡單的離心換液過后就可以直接使用了，其他類型的組織還需要進(jìn)一步解離。

（▲組織預(yù)處理）

02

分離處理

常規(guī)組織處理一般有兩種方法，分別是通過物理機(jī)械剪切和化學(xué)生物酶解來實(shí)現(xiàn)細(xì)胞分離。

物理機(jī)械剪切是使用勻漿機(jī)打散組織或者使用剪刀、銅網(wǎng)或者組織研磨器進(jìn)行的剪碎法、網(wǎng)搓法和研磨法。這種方法成本低，操作簡單、快速，但對組織機(jī)械損傷巨大，而且細(xì)胞分散效果不盡人意，只適用于一些質(zhì)地軟且較為松散的軟組織。

化學(xué)生物酶解法是組織樣本預(yù)處理之后，在酶的作用下，破壞組織間的膠原纖維和彈性纖維，同時(shí)水解粘多糖及其他連接細(xì)胞間的蛋白質(zhì)；或者通過EDTA等化學(xué)物質(zhì)與細(xì)胞上的鈣、鎂離子結(jié)合形成螯合物，利用結(jié)合后的機(jī)械力使細(xì)胞變圓而分散細(xì)胞，尤其對上皮組織的分散效果很好。

使用酶解體系進(jìn)行組織解離時(shí)還需注意酶的選擇和配比，最常使用胰蛋白酶和膠原酶進(jìn)行處理。其中胰蛋白酶對蛋白質(zhì)有水解作用，主要作用于賴氨酸或精氨酸相連接的肽鍵，使細(xì)胞間質(zhì)中的蛋白質(zhì)消化溶解而使細(xì)胞分散開，適用于多種組織。

膠原酶是一種從細(xì)菌中提取出來的酶，對膠原有很強(qiáng)的消化作用。適用于消化纖維性組織、上皮組織以及癌組織，它對細(xì)胞間質(zhì)有較好的消化作用。不同的膠原酶適用的組織也會(huì)有不同。

除上述兩種最常用的消化酶外，還有鏈霉蛋白酶這種解離效果強(qiáng)但容易造成細(xì)胞損傷以及解離效果弱，但對細(xì)胞損傷較小的裂解酶，可以根據(jù)實(shí)際樣本的情況進(jìn)調(diào)整，或者通過復(fù)配聯(lián)用達(dá)到更好的效果，例如可以使用透明質(zhì)酸酶與膠原酶聯(lián)用消化細(xì)胞間基質(zhì)等。

同時(shí)，在進(jìn)行消化處理的時(shí)候佐以機(jī)械剪切，便能使組織分散得更加均勻，樣本處理效果更好。另外實(shí)驗(yàn)操作中還需要注意以下幾點(diǎn)：

• 預(yù)處理好的組織塊需要在緩沖液中清洗，避免影響后續(xù)實(shí)驗(yàn)；

• 酶量和作用時(shí)間應(yīng)根據(jù)組織量及時(shí)調(diào)整，避免消化時(shí)間過長影響細(xì)胞狀態(tài)，期間需要搖晃整個(gè)解離體系以保證組織塊接觸均勻；

• 嚴(yán)格控制溫度濕度條件，雖然胰蛋白酶發(fā)揮效果的最佳溫度是56℃，但是細(xì)胞無法承受如此高溫，所以需要在37℃環(huán)境進(jìn)行處理，另外還有部分組織需要冷消化處理；

• 酶的保存也需要注意，凍干粉要注意防潮，溶解后避免反復(fù)凍融，如蛋白水解酶可以自動(dòng)分解，因此建議在使用前立即將其溶解，并在冰上保存2°C～8°C。

原代細(xì)胞分離過程復(fù)雜，同時(shí)整個(gè)分離處理過程都需要人工參與，機(jī)械剪切過程難以控制實(shí)驗(yàn)可重復(fù)性。隨著科技的進(jìn)步，瑞沃德單細(xì)胞懸液制備儀輕松化解這一難題，自主研發(fā)的組織處理管、酶解試劑盒和內(nèi)置不同組織優(yōu)化處理程序，可將組織制備成高活性單細(xì)胞懸液或組織勻漿。

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根據(jù)實(shí)際樣本可在15-30min內(nèi)完成活性高、均一性好的單細(xì)胞懸液制備，大大增加實(shí)驗(yàn)可重復(fù)性。擁有獨(dú)立運(yùn)行的四通道，搭配加熱套實(shí)現(xiàn)全自動(dòng)處理，提高組織處理效率。廣泛應(yīng)用在單細(xì)胞測序、原代細(xì)胞培養(yǎng)、流式分析、細(xì)胞分選、細(xì)胞治療等研究領(lǐng)域。

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03

過濾清洗→后處理

在分離處理操作結(jié)束后要對樣品進(jìn)行過濾、離心、換液，對獲得的單細(xì)胞懸液進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)和活力分析，終止反應(yīng)并將細(xì)胞置于培養(yǎng)體系或相應(yīng)的緩沖體系中。

（▲活細(xì)胞計(jì)數(shù)）

自動(dòng)細(xì)胞計(jì)數(shù)儀的使用可以對原代細(xì)胞進(jìn)行精準(zhǔn)計(jì)數(shù)，瑞沃德C100自動(dòng)細(xì)胞計(jì)數(shù)儀可配合多熒光通道，對懸液中的細(xì)胞進(jìn)行定量分析，并同時(shí)顯示明場及熒光圖像，清晰呈現(xiàn)計(jì)數(shù)結(jié)果及細(xì)胞形態(tài)。適用于免疫學(xué)及疫苗開發(fā)、細(xì)胞治療、腫瘤研究、干細(xì)胞及代謝研究等研究領(lǐng)域的細(xì)胞分析。

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細(xì)胞培養(yǎng)是原代細(xì)胞分離流程最后一步，瑞沃德二氧化碳培養(yǎng)箱，可精準(zhǔn)控制溫度、二氧化碳濃度，并且是維持高濕度環(huán)境的高性能細(xì)胞培養(yǎng)箱。HEPA高效過濾器可有效去除空氣中的微粒污染，140℃高溫干熱滅菌功能可實(shí)現(xiàn)培養(yǎng)箱的定期滅菌維護(hù)，為原代細(xì)胞樣品提供穩(wěn)定潔凈的培養(yǎng)環(huán)境。

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