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  lxm690724 2016-01-26 00:00:00

  MTT原理 \x09MTT全稱為3-(4，5)-dimethylthiahiazo (-z-y1)-3，5-di- phenytetrazoliumromide，漢語化學(xué)名為 3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴鹽，商品名：噻唑藍(lán).是一種黃顏色的染料. \x09MTT比色法，是一種檢測細(xì)胞存活和生長的方法.其檢測原理為活細(xì)胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶能使外源性MTT還原為水不溶性的藍(lán)紫色結(jié)晶甲瓚（Formazan）并沉積在細(xì)胞中，而死細(xì)胞無此功能.二甲基亞砜（DMSO）能溶解細(xì)胞中的甲瓚，用酶聯(lián)免疫檢測儀在490nm波長處測定其光吸收值，可間接反映活細(xì)胞數(shù)量.在一定細(xì)胞數(shù)范圍內(nèi)，MTT結(jié)晶形成的量與細(xì)胞數(shù)成正比.該方法已廣泛用于一些生物活性因子的活性檢測、大規(guī)模的抗腫瘤藥物篩選、細(xì)胞毒性試驗以及腫瘤放射敏感性測定等.它的特點是靈敏度高、經(jīng)濟(jì). 　　缺點：由于MTT經(jīng)還原所產(chǎn)生的甲瓚產(chǎn)物不溶于水，需被溶解后才能檢測.這不僅使工作量增加，也會對實驗結(jié)果的準(zhǔn)確性產(chǎn)生影響，而且溶解甲的有機(jī)溶劑對實驗者也有損害. MTT 溶液的配制方法 通常，此法中的MTT 濃度為5mg/ml.因此，可以稱取MTT 0.5克，溶于100 ml的磷酸緩沖液（PBS）或無酚紅的培養(yǎng)基中，用0.22μm濾膜過濾以除去溶液里的細(xì)菌，放4℃ 避光保存即可.在配制和保存的過程中，容器Z好用鋁箔紙包住.實驗的時候我一般關(guān)閉超凈臺上的日光燈來避光，覺得這樣比較好. 需要注意的是，MTT法只能用來檢測細(xì)胞相對數(shù)和相對活力，但不能測定細(xì)胞數(shù).在用酶標(biāo)儀檢測結(jié)果的時候，為了保證實驗結(jié)果的線性，MTT 吸光度Z好在0-0.7 范圍內(nèi). \x09MTT一般Z好現(xiàn)用現(xiàn)配，過濾后4ºC避光保存兩周內(nèi)有效，或配制成5mg/ml保存在-20度長期保存，避免反復(fù)凍融，Z好小劑量分裝，用避光袋或是黑紙、錫箔紙包住避光以免分解.我一般都把MTT粉分裝在EP管里，用的時候現(xiàn)配，直接往培養(yǎng)板中加，沒必要一下子配那么多，尤其當(dāng)MTT變?yōu)榛揖G色時就不能再用了. \x09MTT有致癌性，用的時候小心，有條件Z好帶那種透明的簿膜手套.配成的MTT需要無菌，MTT對菌很敏感；往96孔板加時不避光也沒有關(guān)系，畢竟時間較短，或者你不放心的時候可以把操作臺上的照明燈關(guān)掉. \x09配制MTT時用PBS（ph=7.4）溶解.PBS配方：Nacl 8g ＋ Kcl 0.2g ＋ Na2HPO4 1.44g ＋ KH2PO4 0.24g調(diào)pH 7.4，定容1L. 普通MTT法實驗步驟：1：接種細(xì)胞：用含10％胎小牛血清得培養(yǎng)液配成單個細(xì)胞懸液，以每孔1000-10000個細(xì) \x09胞接種到96孔板，每孔體積200ul.2: 培養(yǎng)細(xì)胞：同一般培養(yǎng)條件，培養(yǎng)3-5天（可根據(jù)試驗?zāi)康暮鸵鬀Q定培養(yǎng)時間）.3：呈色：培養(yǎng)3-5天后，每孔加MTT（噻唑藍(lán)）溶液（5mg/ml用PBS配制，pH=7.4)20ul.繼續(xù)孵育4 h， \x09終止培養(yǎng)，小心吸棄孔內(nèi)培養(yǎng)上清液，對于懸浮細(xì)胞需要離心后再吸棄孔內(nèi)培養(yǎng)上清液. \x09每孔加150ul DMSO，振蕩10min，使結(jié)晶物充分融解.4：比色：選擇490nm波長，在酶聯(lián)免疫監(jiān)測儀上測定各孔光吸收值，記錄結(jié)果，以時間為 \x09橫坐標(biāo)，吸光值為縱坐標(biāo)繪制細(xì)胞生長曲線. 藥物MTT法實驗步驟貼壁細(xì)胞：1: 收集對數(shù)期細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞懸液濃度，每孔加入100ul，鋪板使待測細(xì)胞調(diào)密度 1000- \x0910000 孔，（邊緣孔用無菌PBS填充）.2: 5%CO2，37℃孵育，至細(xì)胞單層鋪滿孔底（96孔平底板），加入濃度梯度的藥物，原則上， \x09細(xì)胞貼壁后即可加藥，或兩小時，或半天時間，但我們常在前一天下午鋪板，次日上午 \x09加藥.一般5-7個梯度，每孔100ul，設(shè)3-5個復(fù)孔.建議設(shè)5個，否則難以反應(yīng)真實情況3: 5%CO2，37℃孵育16-48小時，倒置顯微鏡下觀察.4: 每孔加入20ulMTT溶液（5mg/ml，即0.5%MTT），繼續(xù)培養(yǎng)4h.若藥物與MTT能夠反應(yīng)， \x09可先離心后棄去培養(yǎng)液，小心用PBS沖2-3遍后，再加入含MTT的培養(yǎng)液.5: 終止培養(yǎng)，小心吸去孔內(nèi)培養(yǎng)液.6: 每孔加入150ul二甲基亞砜，置搖床上低速振蕩10min，使結(jié)晶物充分溶解.在酶聯(lián)免 \x09疫檢測儀OD490nm處測量各孔的吸光值.7: 同時設(shè)置調(diào)零孔（培養(yǎng)基、MTT、二甲基亞砜），對照孔（細(xì)胞、相同濃度的藥物溶解介 \x09質(zhì)、培養(yǎng)液、MTT、二甲基亞砜）. 懸浮細(xì)胞：1: 收集對數(shù)期細(xì)胞，調(diào)節(jié)細(xì)胞懸液濃度1×106/ml，按次序?qū)ⅱ傺a(bǔ)足的1640（無血清）培 養(yǎng)基40ul ；②加Actinomycin D（放線菌素D有毒性）10ul用培養(yǎng)液稀釋 (儲存液100g/ml，需預(yù)試尋找Z佳稀釋度，1:10-1:20)；③需檢測物10ul；④細(xì)胞懸液50ul（即5×104cell/孔），共100ul加入到96孔板（邊緣孔用無菌水填充）.每板設(shè)對照（加100l 1640） 2: 置37℃，5%CO2孵育16-48小時，倒置顯微鏡下觀察.3: 每孔加入10 ul MTT溶液（5 mg/ml，即0.5%MTT），繼續(xù)培養(yǎng)4 h.（懸浮細(xì)胞推薦使用 WST-1，培養(yǎng)4 h后可跳過步驟4），直接酶聯(lián)免疫檢測儀OD570nm（630nm校準(zhǔn)）測量各孔的吸光值） \x094、離心（1000轉(zhuǎn)x10min），小心吸掉上清，每孔加入100 ul二甲基亞砜，置搖床上低速振蕩10 min，使結(jié)晶物充分溶解.在酶聯(lián)免疫檢測儀OD570nm（630nm校準(zhǔn)）測量各孔的吸光值. \x095、同時設(shè)置調(diào)零孔（培養(yǎng)基、MTT、二甲基亞砜DMSO），對照孔（細(xì)胞、相同濃度的藥物溶解介質(zhì)、培養(yǎng)液、MTT、二甲基亞砜），每組設(shè)定3復(fù)孔. 注意事項：(1) 選擇適當(dāng)?shù)眉?xì)胞接種濃度.(2) 避免血清干擾：一般選小于10％的胎牛血清的培養(yǎng)液進(jìn)行試驗.在呈色后盡量吸盡孔 \x09內(nèi)殘余培養(yǎng)液.(3) 設(shè)空白對照：與試驗平行不加細(xì)胞只加培養(yǎng)液的空白對照.其他試驗步驟保持一致， \x09Z后比色以空白調(diào)零. (4) MTT實驗吸光度Z后要在0-0.7之間，超出這個范圍就不是直線關(guān)系. \x09(5) 用96孔板培養(yǎng)細(xì)胞做MTT測細(xì)胞活力，應(yīng)該加多少1640培養(yǎng)基，多少MTT和DMSO合適 \x09根據(jù)書上說的加200ul1640，20ulMTT，150ulDMSO 加DMSO之前要盡量去掉培養(yǎng)液，便于 \x09DMSO溶解甲臜顆粒進(jìn)行比色測定 \x09(6) 一般每孔4000個細(xì)胞為宜，既細(xì)胞濃度在20000個/ml，MTT加20ul，作用四小時后洗掉上清液，注意不要將甲瓉洗掉，然后每孔加150ul DMSO，在脫色搖床上振蕩10分鐘，然后測吸光值.

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