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  穩(wěn)穩(wěn)雯雯98 2006-11-14 00:00:00

  像細胞這類問題必須要用到顯微鏡 DNA的也是吧

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  Ameiy2011 2006-11-16 00:00:00

  做DNA檢測 誰說DNA測序必須用上用顯微鏡??？ DNA測序技術(shù) 測序目的 測定未知序列 確定重組DNA的方向與結(jié)構(gòu) 對突變進行定位和鑒定 比較研究 測序技術(shù)發(fā)展 70年代末，Walter Gilbert發(fā)明化學(xué)法 Frederick Sanger發(fā)明雙脫氧終止法 手動測序，同位素標記 80年代中期，出現(xiàn)自動測序儀(應(yīng)用雙脫氧終止法原理) 熒光代替同位素，計算機圖象識別 90年代中期，測序儀重大改進 集束化的毛細管電泳代替凝膠電泳 2001年完成人類基因組框架圖 雙脫氧終止法測序原理 利用DNA聚合酶的酶促特點 以單鏈為模板合成DNA的互補鏈 利用2'，3'雙脫氧核苷三磷酸作底物，使之連接在DNA鏈的3'末段，終止鏈的延長. 化學(xué)修飾法測序原理 化學(xué)試劑處理末段DNA片段，造成堿基的特 異性切割，產(chǎn)生一組具有各種不同長度的 DNA鏈的反應(yīng)混合物，經(jīng)凝膠電泳分離. 化學(xué)切割反應(yīng) 包括堿基的修飾 修飾的堿基從其糖環(huán)上轉(zhuǎn)移出去 在失去堿基的糖環(huán)處DNA斷裂 化學(xué)法的優(yōu)缺點 優(yōu)點 模板不需體外酶促反應(yīng)，只要末段標記的DNA片段 無論單鏈或雙鏈 分別標記3'端和5'端可進行雙側(cè)讀取 檢測短的寡核苷酸片段 缺點 方法復(fù)雜費時 末段標記比活性低 測序片段長度250個左右，較短 測序方法(一) 測序方法(二) 自動測序技術(shù) 確定四種熒光發(fā)色基團標記4種脫氧核糖核酸(ddNTP) ——即賦予四組DNA以不同的"顏色" 熒光基團選擇標準 標記方法 標記引物 特定的熒光標記引物與特定的ddNTP保持一致 管1 5'●— + ddATP 管2 5'◆— + ddCTP 管3 5'★— + ddGTP 管4 5'▲— + ddTTP 標記底物 將熒光素連在4種ddNTP ddATP● ddCTP◆ ddGTP★ ddTTP▲ 測序反應(yīng)流程 待測模板 準備DNA模板 計算待測模板用量 DNA模板的使用量依據(jù)DNA的形式而定 質(zhì)粒模板變性 96℃，2分鐘，冷卻至室溫后加入其他成分(PCR產(chǎn)物不需變性). PCR反應(yīng)成分 1μl測序引物(3.2pmol/μl) 4μl測序?qū)Ｓ肞remix 包括10×Buffer， dNTP MIX ddUTP Dye Terminator ddGTP Dye Terminator ddCTP Dye Terminator ddATP Dye Terminator Polymerase Enzyme 用水補足反應(yīng)體積至10μl PCR反應(yīng)條件:96℃，20秒，55℃，20秒，60℃，4分鐘， 共30個循環(huán). 反應(yīng)終止及產(chǎn)物純化 加入反應(yīng)終止液2.5μl(組成為:NaAc 3M，EDTA 0.1M，Glycogen 20mg/ml). 95%冰乙醇沉淀并離心，70%冰乙醇洗滌并離心. 真空抽干沉淀，加入40μl甲酰胺. 加入樣品板開始測序

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