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  rylptuos 2017-11-09 00:00:00

  補(bǔ)體測定 diyi節(jié) 補(bǔ)體的性質(zhì)與活化途徑 一、補(bǔ)體的性質(zhì) 補(bǔ)體（complement，C）：是一組存在于人和脊椎動物(vertebrates)血清及組織液中具有酶樣活性、不耐熱和功能上連續(xù)反應(yīng)的糖蛋白，是抗體發(fā)揮溶細(xì)胞作用的必要補(bǔ)充條件，故稱為補(bǔ)體。 補(bǔ)體系統(tǒng)的功能： 廣泛參與機(jī)體的抗感染防御反應(yīng)， 介導(dǎo)細(xì)胞溶解， 調(diào)理吞噬， 免疫黏附， 參與炎癥反應(yīng)引起機(jī)體免疫損傷等 補(bǔ)體按其性質(zhì)與功能分為三類，即 ? ①補(bǔ)體系統(tǒng)的固有成分，共9種，按先后次序分別命名為C1-C9 ②調(diào)節(jié)和控制補(bǔ)體系統(tǒng)活化的成分，多以其功能命名，如C1YZ物 ③補(bǔ)體受體(CR)，以其結(jié)合對象來命名 二、補(bǔ)體的活化途徑 經(jīng)典途徑 替代途徑 MBL途徑 （一）補(bǔ)體激活的經(jīng)典途徑 是以IgG（1，2，3）或IgM類抗體結(jié)合抗原后的免疫復(fù)合物為主要激活劑，激活過程從C1q開始，補(bǔ)體C1~C9共11種成分全部參與的活化途徑。 二）補(bǔ)體激活的替代途徑 補(bǔ)體激活的替代途徑又稱旁路途徑，與經(jīng)典途徑不同之處在于激活與抗原體復(fù)合物 無關(guān)，是非特異性的，沒有c1，c4和c2參與，直接激活c3，完成c5~c9的激活過程 血清總補(bǔ)體活性測定（CH50試驗） （一）實驗原理 補(bǔ)體Z主要的活性是溶細(xì)胞作用，這種活性很容易通過溶血反應(yīng)進(jìn)行檢測。在一個適當(dāng)?shù)?、穩(wěn)定的反應(yīng)系統(tǒng)中，溶血反應(yīng)對補(bǔ)體的劑量依賴呈一個特殊的S形曲線。在輕微溶血和接近完全溶血時，補(bǔ)體量的變化不能使溶血程度有顯著改變，即溶血對補(bǔ)體量的變化不敏感。但在半溶血（50％溶血）上下時曲線Z陡，即使補(bǔ)體含量僅有較小變動時，溶血程度也會發(fā)生較大的改變，也就是說對補(bǔ)體量的變化非常敏感。故采用50％溶血作為終點(diǎn)指標(biāo)要比100％溶血敏感得多，這一方法稱為補(bǔ)體50％溶血（complement hemolysis 50％），簡稱為CH50。 二)試驗方法 1、綿羊RBC：濃度一般為2%~5% 2、溶血素：即抗綿羊RBC抗體，試驗前應(yīng)在56℃加熱30min或60 ℃加熱30min以滅活補(bǔ)體 3、稀釋緩沖液：磷酸緩沖液或緩沖液 4、50%溶血標(biāo)準(zhǔn)管： 5、取新鮮血清標(biāo)本進(jìn)行試驗。按的要求在各管中加入試劑和反應(yīng)物，一起放37℃水浴箱中溫育30min。 溫育后將所有試管2500r/min離心5min，通過觀察比較，選擇溶血程度與標(biāo)準(zhǔn)管相近的兩管在分光光度計上分別讀取吸光度，以Z接近標(biāo)準(zhǔn)管的那一管定為Z高有效反應(yīng)管，取其稀釋倍數(shù)代入下列公式，求得CH50的測定值（單位U）。 每毫升血清總補(bǔ)體活性（單位）＝ 1/血清用量×稀釋倍數(shù) 三）方法評價 CH50試驗測定的是經(jīng)典途徑總補(bǔ)體溶血活性，所反應(yīng)的是補(bǔ)體9種成分的綜合水平。 方法簡便、快速，但敏感性低，補(bǔ)體的溶血活性除與試驗中反應(yīng)體積成反比外，還與反應(yīng)所用緩沖液的pH、離子強(qiáng)度、鈣鎂濃度、SRBC數(shù)量和反應(yīng)溫度有一定關(guān)系。 鈣鎂離子可穩(wěn)定溶血系統(tǒng)，但過量反而YZ溶血反應(yīng)。 單個補(bǔ)體成分的測定 一、免疫溶血法 二、免疫化學(xué)法 補(bǔ)體結(jié)合試驗 　　補(bǔ)體結(jié)合試驗（complement fixation test，CFT）是用免疫溶血機(jī)制做指示系統(tǒng)，來檢測另一反應(yīng)系統(tǒng)抗原或抗體的試驗。早在1906年Wasermann就將其應(yīng)用于梅毒的診斷，即的華氏反應(yīng)。 這一傳統(tǒng)的試驗經(jīng)不斷改進(jìn)，除了用于傳染病診斷和流行病學(xué)調(diào)查以外，在一些自身抗體、腫瘤相關(guān)以原以及HLA的檢測和分析中也有應(yīng)用。 一、試驗原理 該試驗中有5種成分參與反應(yīng)，分屬于3個系統(tǒng)： ①反應(yīng)系統(tǒng)，即已知的抗原（或抗體）與待測的抗體（或抗原）； ②補(bǔ)體系統(tǒng)； ③指示系統(tǒng)，即SRBC與相應(yīng)溶血素，試驗時常將其預(yù)先結(jié)合在一起，形成致敏紅細(xì)胞。 反應(yīng)系統(tǒng)與指示系統(tǒng)爭奪補(bǔ)體系統(tǒng)，先加入反應(yīng)系統(tǒng)給其以優(yōu)先結(jié)合補(bǔ)體的機(jī)會。 二、試驗方法 　　補(bǔ)體結(jié)合試驗的改良方法較多，較常用的有全量法(3ml)、半量法(1.5ml)、小量法(0.6ml)和微量法（塑板法）等。目前以后兩種方法應(yīng)用較為廣泛，因為可以節(jié)省抗原，血清標(biāo)本用量較少，特異性也較好。以下敘述以小量法為例，即抗原、抗體、溶血素、羊紅細(xì)胞各加0.1ml，補(bǔ)體加0.2ml，總量為0.6ml。 （一）試劑 1．抗原：試驗中用于檢測抗體的抗原應(yīng)適當(dāng)提純，純度愈高，特異性愈強(qiáng)。如使用粗制抗原時，須經(jīng)同樣處理的正常組織作抗原對照，以識別待檢血清中可能存在的、對正常組織成分的非特異性反應(yīng)。 2．抗原和抗本的滴定：補(bǔ)體結(jié)合試驗中，抗原與抗體按一定比例結(jié)合，因而應(yīng)通過試驗選擇適宜的濃度比例。多采用方陣法進(jìn)行滴定，選擇抗原與抗體兩者都呈強(qiáng)陽性反應(yīng)（100％不溶血）的Z高稀釋度作為抗原和抗體的效價（單位）。 3、補(bǔ)體的滴定：一般用豚鼠補(bǔ)體，補(bǔ)體滴定9逐步加入各試劑，溫育后觀察Z少量補(bǔ)體能產(chǎn)生完全溶血者，確定為1個實用單位，正式試驗中使用2個實用單位。 （二）血清標(biāo)本 　　采集血液標(biāo)本后及時分離血清，及時檢驗或?qū)⒀灞４嬗冢?0℃。血清在試驗前應(yīng)先加熱56℃30min（或60℃3min）以破壞補(bǔ)體和除去一些非特異因素。 血清標(biāo)本遇有抗補(bǔ)本現(xiàn)象時可做下列處理之一：①加熱提高12 ℃ ； ②－20℃凍融后離心去沉淀； ③以3mmol/L鹽酸處理； ④加入少量補(bǔ)體后再加熱滅活； ⑤以白陶土處理； ⑥通入CO2； ⑦以小白鼠肝粉處理； ⑧用含10％新鮮雞蛋清的生理鹽水稀釋補(bǔ)體。 （三）正式試驗 　　以小量法測定抗體的補(bǔ)體結(jié)合試驗為例。逐步加入各種試劑，溫育后先觀察各類對照管，應(yīng)與預(yù)期的結(jié)果吻合。 三、方法評價 　　補(bǔ)體結(jié)合試驗是一種傳統(tǒng)的免疫學(xué)技術(shù)，能夠沿用至今說明它本身有一定的優(yōu)點(diǎn)：①靈敏度高。補(bǔ)體活化過程有放大作用，比沉淀反應(yīng)和凝集反應(yīng)的靈敏度高得多，能測定0.05μg/ml的抗體，可與間接凝集法的靈敏度相當(dāng)。②特異性強(qiáng)。各種反應(yīng)成分事先都經(jīng)過滴定，選擇了Z佳比例，出現(xiàn)交叉反應(yīng)的機(jī)率較小，尤其用小量法或微量法時。③應(yīng)用面廣，可用于檢測多種類型的抗原或抗體。④易于普及，試驗結(jié)果顯而易見；試驗條件要求低，不需要特殊儀器或只用光電比色計即可。

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