AnielloFederico*,JochenUtikalSkinCancerUnit,GermanCancerResearchCenter(DKFZ),69120Heidelberg,Germany.*Correspondingauthor.E-mailaddress:a.federico@dkfz-heidelberg.de

為了研究腫瘤微環(huán)境影響下腫瘤細(xì)胞的運(yùn)動性和侵襲特性，建立了體外2D侵襲方案。這種2D侵襲方案是一種共培養(yǎng)試驗(yàn)，在這種情況下，是由腫瘤和基質(zhì)細(xì)胞（例如成纖維細(xì)胞）組成的。一旦兩種細(xì)胞類型接觸，在不同的條件下評估侵襲成纖維細(xì)胞單層的腫瘤細(xì)胞的數(shù)量，在我們的研究中，我們在模擬實(shí)體腫瘤微環(huán)境中發(fā)現(xiàn)的條件，例如與基質(zhì)細(xì)胞（成纖維細(xì)胞）的相互作用以及成纖維細(xì)胞釋放的可溶性因子（Nnetu等，2012）。我們使用A375黑色素瘤細(xì)胞系和真pi成纖維細(xì)胞進(jìn)行了此測定。黑色素瘤細(xì)胞激活成纖維細(xì)胞，繼而維持腫瘤細(xì)胞的生長，惡性轉(zhuǎn)化和耐藥性（Flach等，2011）。然而，在刺激所測試的抗ai化合物后，我們發(fā)現(xiàn)與成纖維細(xì)胞直接接觸的黑素瘤細(xì)胞顯示出運(yùn)動能力受損并且未能侵襲成纖維細(xì)胞層。

材料和試劑

1. GFP-A375細(xì)胞系（ATCC）

2. 番茄皮成纖維細(xì)胞（從健康患者中分離）

3. MEF細(xì)胞培養(yǎng)基

4.PBS（Sigma-Aldrich；D8537）

5.胰蛋白酶-EDTA溶液（Sigma-Aldrich；T3924）

6. 臺盼藍(lán)溶液（Sigma-Aldrich;93595）

7.DMSO（CarlRoth;A994.2），在0.1％最終濃度下使用

8.MithramycinA（BioTrend；10-2085-5mg），在300nm濃度下使用，用DMSO稀釋

儀器設(shè)備

1. 層流凈化罩

2. 12/24孔多孔板（GreinerBio-One）

3. 臺式離心機(jī)

4. 細(xì)胞計(jì)數(shù)器

5. 2孔插件（ibidi: 80209）/預(yù)置2孔插件培養(yǎng)皿（ibidi:81176）

6.細(xì)胞培養(yǎng)管

7. 渦旋

8. 鑷子

9. 光學(xué)顯微鏡

10. 熒光顯微鏡

11. NIS-Elements軟件

ibidi:81176

實(shí)驗(yàn)流程

01. 將GFP-A375和番茄成纖維細(xì)胞系穩(wěn)定地保存在MEF培養(yǎng)基中，在37°C和5%C02加濕培養(yǎng)箱中。

02. 當(dāng)細(xì)胞達(dá)到亞融合度（約80％融合度）時，在帶有PBS的通風(fēng)櫥中清洗它們，以去除死細(xì)胞和碎片。

03. 在培養(yǎng)箱中用胰蛋白酶-EDTA溶液胰蛋白酶消化細(xì)胞約5分鐘，然后添加MEF培養(yǎng)基以阻止反應(yīng)。

04. 將細(xì)胞懸浮液收集在15ml細(xì)胞培養(yǎng)管中，并用臺式離心機(jī)（1500xg,5′,RT）短暫離心。

05. 將細(xì)胞重新懸浮在新鮮培養(yǎng)基中；將一體積的細(xì)胞懸液與另一體積的臺盼藍(lán)溶液混合，用細(xì)胞計(jì)數(shù)器計(jì)數(shù)活細(xì)胞。

06. 在MEF緩沖液中以4x105細(xì)胞/ml的濃度稀釋細(xì)胞。

07. 在多孔板上，在每個孔的中間放置一個Culture-Insert2孔（2孔培養(yǎng)插件）。

08. 用75μl（3x104細(xì)胞）FP-A375細(xì)胞填充插入物一側(cè)，并用番茄成纖維細(xì)胞填充另一側(cè)。用移液器上下混合插入物中的細(xì)胞，以確保細(xì)胞完全分布。

09. 將多孔板放在培養(yǎng)箱中，放置過夜。

10. 第二天，在鑷子的幫助下，小心地從每孔中取出培養(yǎng)基和插件，并用PBS清洗。

11. 小心除去PBS，然后加入新鮮的MEF培養(yǎng)基。

12. 用光學(xué)顯微鏡檢查GPF-A375與Tomto成纖維細(xì)胞之間產(chǎn)生的間隙的閉合狀態(tài)。

13. 一旦每個孔中的間隙完全閉合，請使用熒光顯微鏡和成像軟件獲取熒光圖像。確保腫瘤細(xì)胞尚未侵入成纖維細(xì)胞單層。

14. 小心地除去培養(yǎng)基，并在控制組孔中添加培養(yǎng)基+0.1％PBS，在處理組孔中添加培養(yǎng)基+300nM絲裂霉素A。將板放在培養(yǎng)箱中24小時（處理孵育時間）。

24小時后，在熒光顯微鏡下重新采集共培養(yǎng)孔，以評估治療組與對照組（綠色熒光細(xì)胞散布在紅色標(biāo)記層上）的腫瘤細(xì)胞侵襲行為的任何變化（圖2）。

圖1：2D侵襲系統(tǒng)的示意圖

圖2：2D侵襲檢測的熒光圖像

將黑素瘤細(xì)胞和成纖維細(xì)胞共培養(yǎng)，然后暴露于300nmMithramycinA（或DMSO）。24小時后，評估侵襲成纖維細(xì)胞層的腫瘤細(xì)胞的數(shù)目。A375細(xì)胞顯示出大規(guī)模的侵襲行為，受到MithramycinA治療的損害。比例尺：500μm。

備注：

1.此處描述了MEF培養(yǎng)基組成（參考文獻(xiàn)1）。

2.此文僅供參考。

3.此實(shí)驗(yàn)方案來自ibidi的實(shí)際用戶，更多詳情可聯(lián)系本文作者。

參考文獻(xiàn)：

1.MithramycinAandmithralogEC-8042inhibitSETDB1expressionanditsoncogenicactivityinmalignantmelanoma. FedericoA,SteinfassT,LarribèreL,NovakD,MorísF,Nú?ezLE,UmanskyV,UtikalJ.MolelucarTherapy-Oncolytics2020;doi: https://doi.org/10.1016/j.omto.2020.06.001 (Methoddescribedinthisprotocolwasincludedinthispublishedarticle).

2.Theimpactofjammingonboundariesofcollectivelymovingweak-interactingcells. NnetuKD,KnorrM,K?sJ,ZinkM.NewJournalofPhysics2012;doi:https://doi.org/10.1088%2F1367-2630%2F14%2F11%2F115012

3.Fibroblastscontributetomelanomatumorgrowthanddrugresistance. FlachEH,RebeccaVW,HerlynM,SmalleyKS,AndersonAR.Molecular pharmaceutics2011;doi:10.1021/mp200421k