你在進行光纖記錄實驗時，是否有如下煩腦：

◆ 記錄好的數(shù)據(jù)看著很雜亂，不知如何整理？

◆ 數(shù)據(jù)處理包含哪些步驟？

◆ 如何確定數(shù)據(jù)分析的baseline

◆ ΔF/F指的是什么？

◆ 信號出現(xiàn)了“漂白效應(yīng)”怎么辦？

無需困惑，對以上問題，我們最近總結(jié)了一份實操步驟，這份操作指南可幫你迅速上手數(shù)據(jù)處理

常見光纖記錄數(shù)據(jù)處理過程

讓我們來看一張原始數(shù)據(jù)案例圖，下圖顯示數(shù)據(jù)整體波動過于密集，其中410nm對照通道數(shù)據(jù)不夠穩(wěn)定；對應(yīng)事件標記（線條標記處）的peak也不是很突出，針對這種數(shù)據(jù)情況，我們立刻開始數(shù)據(jù)處理吧。

（▲本文實操分析案例圖）

（*以下分析過程以瑞沃德雙色多通道光纖記錄系統(tǒng)操作界面為主要示例）

01.第 一步

我們將數(shù)據(jù)根據(jù)需要分析的時間段進行裁剪，此步驟也可跳過。

02.第二步

數(shù)據(jù)預(yù)處理。常見數(shù)據(jù)預(yù)處理過程包含平滑處理，基線矯正，運動矯正。平滑處理可以將數(shù)據(jù)中的過多雜信號去除，ZD限度的突出目標peak。如下圖所示，原始數(shù)據(jù)經(jīng)平滑處理后目標peak更加突出，更容易觀察分析。

基線矯正多數(shù)針對的是熒光信號因長時間記錄導(dǎo)致漂白信號逐步下降，或者光纖的自發(fā)熒光在長期記錄下逐步被漂白基線逐步下降等情況。此情形的數(shù)據(jù)因為整體呈現(xiàn)下降趨勢，不利于后續(xù)數(shù)據(jù)作圖分析，所以需要進行基線矯正。如下圖所示，基線矯正可以直接將下降趨勢的數(shù)據(jù)通過算法擬合后恢復(fù)成平整狀態(tài)。

運動矯正用于采用410nm對照通道的數(shù)據(jù)，410nm數(shù)據(jù)可以用于反應(yīng)背景噪音信號，運動矯正即將410nm數(shù)據(jù)與470nm數(shù)據(jù)進行擬合，通過算法從470數(shù)據(jù)中去除410nm數(shù)據(jù)的波動，得到真實的熒光數(shù)據(jù)。當不選擇運動矯正功能或者實驗未記錄410nm的數(shù)據(jù)，可以選擇一定時間范圍內(nèi)的信號作為對照進行算法處理。

03.第三步

數(shù)據(jù)預(yù)處理后即可得到整體數(shù)據(jù)的ΔF/F或者Z-score，用于反應(yīng)數(shù)據(jù)的波動幅度。二者采用了不同的算法，數(shù)據(jù)的呈現(xiàn)結(jié)果略有不同。

ΔF/F=（F-F1）/F0：

（1）當數(shù)據(jù)進行基線矯正后：

◆ 若對照選擇為410，F(xiàn)1=fitted410，F(xiàn)0=median（raw data）

◆ 若對照選擇非410：F1為基線矯正曲線值，F(xiàn)0=median（Baseline）

（2）當數(shù)據(jù)未進行基線矯正：

◆ 若數(shù)據(jù)對照為410，則F1=F0=fitted410，

◆ 若數(shù)據(jù)對照非410，則F1=F0=median（Baseline）

Z-score：

使用標準分數(shù)計算方式，即z-score=（x-mean）/std，x=ΔF/F，mean為ΔF/F的均值，std為相應(yīng)標準差。

04.第四步

將熒光數(shù)據(jù)與動物行為數(shù)據(jù)同步對比，選擇事件標記或者增加事件標記。

05.第五步

選擇事件分析的時間區(qū)間和baseline區(qū)間，用于事件相關(guān)信號分析作圖。

06.第六步

將不同組的數(shù)據(jù)進行組間對比，即可分析不同處理因素下熒光數(shù)據(jù)的差異。

通過以上步驟，原始的熒光數(shù)據(jù)就可以直接出圖啦。

空軍軍醫(yī)大學(xué)光纖記錄系統(tǒng)培訓(xùn)現(xiàn)場

（▲瑞沃德雙色多通道光纖記錄系統(tǒng)）（▲瑞沃德雙色多通道光纖記錄系統(tǒng)）

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一、光纖記錄工作原理

人類的大腦擁有約900億個神經(jīng)元，神經(jīng)元之間通過突觸相互連接形成了復(fù)雜的神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)，并由此產(chǎn)生各種復(fù)雜的功能。大腦能夠合成和釋放上百種神經(jīng)遞質(zhì)，神經(jīng)信號通過突觸釋放的神經(jīng)遞質(zhì)從而在神經(jīng)元之間進行傳遞（圖1）。

圖1

當神經(jīng)興奮傳導(dǎo)到突觸末端時，會刺激突觸上鈣離子通道打開促使鈣離子大量內(nèi)流，胞內(nèi)鈣離子濃度瞬時上升，驅(qū)動突觸小泡將神經(jīng)遞質(zhì)釋放到突觸間隙中，釋放出的神經(jīng)遞質(zhì)隨即與突觸后膜上的受體結(jié)合，將遞質(zhì)信號傳遞給下一個神經(jīng)元，從而進行信息的逐級傳遞（圖2）。這些神經(jīng)元以復(fù)雜的通路投射到多個腦區(qū)，產(chǎn)生了學(xué)習(xí)認知、情感、控制、動機、獎勵等豐富的功能。光纖記錄系統(tǒng)則可以通過檢測鈣離子和神經(jīng)遞質(zhì)的熒光變化程度來表征群體神經(jīng)元的活動情況。

圖2

那么光纖記錄是如何檢測神經(jīng)活動的呢？

以鈣離子熒光信號檢測為例，光纖記錄系統(tǒng)的技術(shù)原理是借助鈣離子濃度變化與神經(jīng)元活動之間的嚴格對應(yīng)關(guān)系，利用特殊的熒光染料或者蛋白質(zhì)熒光探針，將神經(jīng)元中鈣離子的濃度通過熒光強度表現(xiàn)出來，并被光纖記錄系統(tǒng)捕捉，從而達到檢測神經(jīng)元活動的目的。

在神經(jīng)系統(tǒng)中，靜息狀態(tài)時神經(jīng)元胞內(nèi)鈣離子濃度為50-100nM，而在神經(jīng)元興奮時胞內(nèi)鈣離子濃度能上升10-100倍，因此我們可以通過注射鈣離子基因編碼指示劑（Calcium indicator，如GCaMPs、RCaMPs等）來標記鈣離子。鈣離子指示劑帶有熒光蛋白（如GFP、RFP等）及其變異體的蛋白質(zhì)，可與鈣調(diào)蛋白（CaM）和肌球蛋白輕鏈激酶M13域結(jié)合（圖3左）。當神經(jīng)活動增強時鈣離子通道打開，大量鈣離子內(nèi)流并與CaM結(jié)合，導(dǎo)致M13和CaM結(jié)構(gòu)域相互作用，引發(fā)cpEGFP結(jié)構(gòu)重排，從而增強綠色熒光信號（圖3 右）。

因此我們可以通過檢測鈣信號的變化來表征神經(jīng)元的活動，進而研究神經(jīng)元活動與動物行為的相關(guān)性，探究復(fù)雜行為背后的調(diào)控機制。

圖3

(Marisela Morales, et al. Neuron, 2020)

圖4：VTA-VGluT2神經(jīng)元編碼先天逃避反應(yīng)

光纖記錄檢測神經(jīng)遞質(zhì)信號的原理與上述方法相同，把cpEGFP嵌入特定的神經(jīng)遞質(zhì)受體，受體與神經(jīng)遞質(zhì)結(jié)合后會引發(fā)受體構(gòu)象改變并發(fā)出熒光信號（圖5）。通過病毒注射、轉(zhuǎn)染等技術(shù)手段，可以將這種可遺傳編碼的探針表達在細胞或小鼠腦部，借助成像技術(shù)，觀察神經(jīng)遞質(zhì)濃度的實時變化。

圖5

(Yulong Li, et al. Cell, 2018)

圖6：條件反射實驗中伏隔核Nac腦區(qū)的DA釋放

二、光纖記錄實驗方法

在光纖記錄實驗中，首先要選擇合適的熒光病毒。熒光染料或指示劑是通過病毒載體轉(zhuǎn)入目標腦區(qū)，常用載體為AAV病毒。根據(jù)實驗的不同，需要選擇特異啟動子或者Cre-FloxP系統(tǒng)來特異標記目標神經(jīng)元，無特異性的GCaMPs表達雖然可以觀測群體神經(jīng)元活動但無神經(jīng)元特異性，光纖記錄的作用在于觀測特異類型神經(jīng)元群體的活動。

實驗流程：

1、在目標腦區(qū)注射鈣熒光病毒，并在注射位點埋植光纖插針，用于收集熒光；

圖7：病毒注射與陶瓷插針埋植

2、待2-3周鈣熒光病毒表達后，連接光纖，使用光纖記錄系統(tǒng)采集動物在行為學(xué)實驗中大腦的鈣熒光信號；

圖8：病毒表達

3、通過分析軟件處理鈣熒光信號數(shù)據(jù)，并結(jié)合行為學(xué)視頻對動物的行為進行分析。

圖9：光纖記錄結(jié)合高架十字迷宮實驗

三、光纖記錄數(shù)據(jù)分析

以瑞沃德R820三色光纖記錄系統(tǒng)記錄的數(shù)據(jù)為例。

1、數(shù)據(jù)預(yù)處理。R820三色光纖記錄系統(tǒng)軟件集信號采集與數(shù)據(jù)分析于一體，在數(shù)據(jù)分析中，數(shù)據(jù)預(yù)處理過程包含平滑處理，基線矯正，運動矯正等功能。

平滑處理可以將數(shù)據(jù)中的過多雜信號去除，最大限度的突出目標peak?；€矯正多數(shù)針對的是熒光信號因長時間記錄導(dǎo)致漂白信號逐步下降，或者光纖的自發(fā)熒光在長期記錄下逐步被漂白基線逐步下降等情況。此情形的數(shù)據(jù)因為整體呈現(xiàn)下降趨勢，不利于后續(xù)數(shù)據(jù)作圖分析，所以需要進行基線矯正。運動矯正用于采用410nm對照通道的數(shù)據(jù)，410nm數(shù)據(jù)可以用于反應(yīng)背景噪音信號，運動矯正即將410nm數(shù)據(jù)與470nm數(shù)據(jù)進行擬合，通過算法從470數(shù)據(jù)中去除410nm數(shù)據(jù)的波動，得到真實的熒光數(shù)據(jù)。

圖10：光纖記錄數(shù)據(jù)預(yù)處理

2. 將熒光數(shù)據(jù)與動物行為數(shù)據(jù)同步對比，選擇事件標記或者增加事件標記，事件相關(guān)信號分析作圖。

圖11：事件分析

3. 將不同組的數(shù)據(jù)進行組間對比，即可分析不同處理因素下熒光數(shù)據(jù)的差異。此外，還可結(jié)合行為學(xué)視頻同步分析動物的運動軌跡。

圖12：不同數(shù)據(jù)組間分析

通過以上步驟，原始的熒光數(shù)據(jù)就可以直接出圖啦。

光纖記錄實驗的工作原理，實驗方法以及數(shù)據(jù)分析已經(jīng)全部講完啦….

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讓實驗信號更強更準

　　細胞爬片的操作方法以及技巧!

　　在醫(yī)學(xué)生物研究中，免疫熒光檢測等需用到細胞爬片。現(xiàn)有的細胞爬片多采用表面平整、光滑的透明玻璃玻片。但在做免疫熒光檢測時，為了節(jié)約抗體，需免疫組化筆在爬片上進行范圍的圈定，將抗體加入劃定區(qū)域，免疫組化筆中的疏水成分阻滯抗體溢出所圈定的范圍，從而達到節(jié)約抗體的目的。細胞爬片是細胞培養(yǎng)中比較經(jīng)常會用到的，現(xiàn)將自己操作的一些方法與技巧拿與大家分享。

　　細胞爬片的特點:

　　1.玻片表面經(jīng)過TC處理，雙面均可使用。

　　2.γ射線滅菌，保證無菌。

　　3.使用便捷，只需打開包裝，將爬片放入孔板內(nèi)，將細胞懸液滴到爬片上即可培養(yǎng)。

　　4.爬片厚度為0.17mm，直徑為8mm/14mm/20mm/25mm.分別適用于48孔細胞培養(yǎng)板/24孔細胞培養(yǎng)板/12孔細胞培養(yǎng)板/6孔細胞培養(yǎng)板。

　　5.吸附：該玻片表面具有陽離子電荷，可以通過靜電作用吸附冰凍切片組織或細胞，使之粘附在玻片上，進而在玻璃和切片組織之間形成共價鍵.因此，無需粘黏劑或者蛋白包被，該玻片也能牢固的粘附切片或細胞。

　　爬片的準備:

　　1、爬片可用一般的蓋玻片，也可用專用爬片;

　　2、應(yīng)用蓋玻片，可根據(jù)自己的需要剪裁成合適的大小，以備置于6孔板、12孔板或24孔板;

　　3、將剪裁好的爬片，置于濃硫酸中浸泡并過夜，第二天先用自來水沖洗20遍，再用三蒸水沖洗3遍(個人認為主要目的是沖洗干凈就可以了)，放在飯盒或者培養(yǎng)皿(一定是玻璃的哦，要不然就……)中烘干后進行高壓消毒。

　　培養(yǎng)板的準備:

　　1、泡酸過夜

　　2、沖洗，烘干(1、2步驟與前大致相同)

　　3、放入超凈工作臺用紫外線照1～2小時就可以用了(在照之前可以將爬片一并放入，若細胞貼壁能力不強，可經(jīng)多聚賴氨酸浸片后放入。貼壁能力強的話，就可以省略了，進行紫外線消毒)

　　注：此步自己的經(jīng)驗是爬片可以先浸入消毒后的PBS內(nèi)，緊接著放入培養(yǎng)板內(nèi)。目的：浸過PBS的爬片依靠表面的液體，可以用培養(yǎng)板孔底貼和緊密，以利于細胞長到爬片上。(自己剛開始做的時候，經(jīng)常就是細胞全都長在了爬片與培養(yǎng)板之間，爬片上細胞罕見。)

　　細胞爬片:

　　1、胰酶消化細胞后計數(shù)

　　2、根據(jù)自己的需要選擇合適的細胞密度種入培養(yǎng)板內(nèi)即可

　　3、第二天即可進行干預(yù)措施　　細胞爬片的操作方法以及技巧!先和大家介紹到這，如果想要了解更多細胞爬片的信息，可以關(guān)注天津本生，本生給生物醫(yī)藥客戶提供生物實驗室檢測試劑及耗材，歡迎廣大客戶來詢。

近期，安泰測試給西安某研究所交付一臺高電阻/低電流靜電計Keithley6430，并為客戶提供了實操演示。吉時利靜電計Keithley 6430具有超低噪聲0.4fA p-p和前置放大器，廣泛用于低電平信號測量比如研究單電子器件、高電阻納米線和納米管、聚合物以及電化學(xué)等應(yīng)用。

6430源表輸出四象限示意圖

和其他型號的源表類似，Keithley 6430具備四象限輸出能力，在六位半的精度下實現(xiàn)1μV - 200V、10aA - 100mA、1μ? - >20T?的電壓，電流，電阻測量和0 - ±200V、 0 ±100mA的輸出能力。

吉時利靜電計6430源表實物照片

吉時利靜電計Keithley 6430操作方法：

從面板按鍵可以看出，6430源表的主要功能是電壓V、電流I、電阻R的測量，左邊是測量功能設(shè)置區(qū)域，右邊是源輸出設(shè)置區(qū)域

儀器背面板是接線端口，使用兩線制測量用INPUT/OUTPUT兩個極；四線制測量只需要連接好4-WireSENSE端口即可，內(nèi)部會識別自動進行四線制測量；

在實際加壓測流、或是加流測壓方式測電阻時，先設(shè)置好源輸出V（限制電壓）和I（恒流模式），或者輸出V（恒壓模式）和I（限制電流）；然后設(shè)置DisplayMeasure界面，觀測電阻值；

如果需要同時監(jiān)控電阻和實際電流，或者電流和電壓值，可以設(shè)置Toggle，進行顯示。

6430前置放大器模塊

前置放大器的使用方法：

前置放大器是6430的特色設(shè)計，使得用戶可以直接， 或者近距離連接該信號，減少線纜噪聲的影響。前置放大器屬于雙向放大器，既可以放大測量信號，也可以對源輸出信號進行放大，用于測量或產(chǎn)生被測試器件的電流。

開箱后，將前置放大器接線端口蓋用螺絲刀拆開，一端連接主機背后的PreAMP端口，一端連接放大器模塊，放大器上有一頭是2個BNC端口，用于連接三同軸線纜；根據(jù)需要，通常連接Input/Output口進行兩線制測量。

前置放大器不需要特別對儀器設(shè)置，連接后自動識別可以直接使用。

注意：本設(shè)備具有高壓輸出能力，在連線時請關(guān)閉電源，切忌帶電操作。

本文由安泰測試整理發(fā)布，歡迎各位關(guān)注微信公眾號“安泰測試”留言探討。更多儀器知識歡迎訪問安泰測試網(wǎng)。

光纖記錄實驗操作較為簡便，能夠長時間穩(wěn)定的動態(tài)檢測動物的神經(jīng)信號，目前在神經(jīng)科學(xué)研究中應(yīng)用越發(fā)廣泛。但是在做光纖記錄實驗中，有時會遇到采集不到熒光信號的情況，各位小伙伴是否也曾遇到過？今天，小沃帶大家梳理一遍采集不到信號的可能原因及實驗注意事項，助你實驗更順暢！

01病毒

1.病毒是否存在反復(fù)凍融現(xiàn)象，反復(fù)凍融會降低病毒滴度，從而影響病毒轉(zhuǎn)染效率。因此光纖記錄實驗中，病毒應(yīng)即拿即用，避免凍融。

2.病毒與目標腦區(qū)神經(jīng)元特異性結(jié)合程度也會影響熒光信號。

02病毒注射

1.手術(shù)前定位：通過預(yù)實驗對腦區(qū)精準定位（可通過臺盼藍注射定位）。在病毒注射前，我們可以先注射臺盼藍進行預(yù)實驗以達到練手的目的，提高后面實驗的成功率。

腦區(qū)坐標定位參考：調(diào)平時注意左右高度差小于0.03mm。

2.病毒注射：選擇較細直徑的玻璃電極可以減少注射損傷，對于淺層腦區(qū)注射，可減少病毒泄露。病毒注射后留針10min。

3.病毒注射檢測：切腦片看熒光表達。

熒光染色實驗拍不出帶有熒光的細胞，可能原因是顯微鏡聚焦未在神經(jīng)細胞這一層上（如上圖出現(xiàn)模糊團狀，可能會是細胞）、注射的腦區(qū)與病毒反應(yīng)的特異性神經(jīng)元數(shù)量太少、或是熒光淬滅掉了。

注意事項：

如果病毒沒注射成功，可能原因有手術(shù)中腦區(qū)定位有偏差導(dǎo)致病毒注射位置不對（目標腦區(qū)很小的話會常存在這個問題）、病毒注射后順著腦室流走、病毒注射后未留針導(dǎo)致病毒順著注射孔被析出。

03陶瓷插針埋植位置

1.病毒注射與陶瓷插針植入可以在同一個手術(shù)進行，避免二次手術(shù)對小鼠造成傷害；

2.選擇合適的夾持器，滿足不同深度及相對距離的植入手術(shù)；

3.定期查看定位儀操作臂與夾持器的固定情況，防止角度偏差。

病毒注射表達區(qū)域與陶瓷插針的植入位置需要保持接近，根據(jù)文獻中數(shù)據(jù)，超過100μm就會明顯影響信號強度。

HanQin et al., Neurophoton,2019

04耗材參數(shù)搭配

1.光纖記錄實驗對環(huán)境光比較敏感，建議實驗在光線相對穩(wěn)定、昏暗的環(huán)境下進行。光纖記錄更適合選擇黑色陶瓷插針與黑色陶瓷套管，可避免環(huán)境光對熒光信號的影響；

2.較大數(shù)值孔徑的耗材有助于熒光信號的傳輸，所有的配件耗材保持相同的芯徑、NA數(shù)值更有助于實驗記錄；

3.使用高強度的激光器對光纖進行漂白，使得光纖等耗材的自發(fā)熒光降低，減少噪聲干擾。

光纖漂白器

05光纖記錄參數(shù)設(shè)置

1.首先檢查線路連接：包括光纖與機器連接的端口，光纖與小鼠連接的端口（并使用酒精擦拭光纖端口和鏡頭）。

2.調(diào)高曝光時間：Cmos相機拍攝時間增加，有助于采集到熒光信號。

注意事項：

1.若未記錄到信號，可適當調(diào)高光源功率；

2.動物腦區(qū)較大，病毒注射量可適量增加；

3.病毒注射后也可先不埋植插針，待2-3周后病毒表達，陶瓷插針連接光纖一起植入，邊植入插針邊檢測鈣信號。

瑞沃德三色多通道光纖記錄系統(tǒng)

產(chǎn)品特點：

• 最大支持9通道同時采集，滿足多只動物或多個腦區(qū)位點同時實驗；

• 高靈敏雙檢測器，獨立分時序采集，避免熒光串擾；

• 專業(yè)集成信號采集、數(shù)據(jù)分析、行為學(xué)采集分析模塊；

• 輸出信號參數(shù)自定義調(diào)節(jié)，可進行多種觸發(fā)，實現(xiàn)刺激和記錄的閉環(huán)控制；

• 兼容光遺傳學(xué)，實現(xiàn)同一位點記錄和刺激。

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光纖記錄（Fiber photometry）通過時間相關(guān)單光子計數(shù)(TCSPC)的光纖光學(xué)來測量熒光分子在大腦中發(fā)出的光信號?；诨驹?，使用直徑較小的光纖探頭就能實現(xiàn)傳輸并收集熒光信號，將采集到的發(fā)射信號通過二色鏡進行光譜分離，并通過濾波器聚焦到探測器上，即可檢測出熒光的實時動態(tài)變化。

所以光纖記錄方法的優(yōu)勢主要在于：

1. 植入的光纖探頭體積小且柔韌性好，使得周圍組織損傷較??；

2. 因為植入光纖體積小，方便同時記錄多個大腦區(qū)域的信號；

3. 基于TCSPC的光纖是檢測發(fā)射光的超靈敏工具，滿足在低強度激發(fā)光下即可檢測熒光，從而減少了光漂白的機會，并延長了記錄時間。

目前光纖記錄常用于檢測鈣信號及神經(jīng)遞質(zhì)信號變化，背后原理是通過給實驗動物注射基因編碼型的熒光探針/生物傳感器，隨后通過光纖記錄即可檢測到對應(yīng)神經(jīng)信號的變化?；蚓幋a生物傳感器是一類生物分子信號介質(zhì)，它被整合到細胞的基因組中，然后由細胞的分子機制產(chǎn)生。這些蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)可以被設(shè)計成在化學(xué)物質(zhì)存在或細胞環(huán)境變化時改變構(gòu)象，從而產(chǎn)生熒光信號。

常見的基因編碼型的生物傳感器根據(jù)應(yīng)用場景主要分為：

1、膜去極化。一旦動作電位(AP)被激活，AP將沿軸突向下傳播，并使突觸前鈕扣對應(yīng)的膜去極化(從?65 mV到+40 mV或更大)。這種膜去極化作為神經(jīng)元激活的分子特征，可以通過遺傳編碼的電壓指示探針(GEVIs)檢測；

2、電壓門控Ca2+通道激活和輸入。當膜去極化發(fā)生在突觸前活躍區(qū)，電壓門控Ca2+通道打開，導(dǎo)致Ca2+快速內(nèi)流。這種升高的細胞質(zhì)Ca2+濃度(從~100-~400nM)的變化可以持續(xù)約50-150毫秒，通過基因編碼Ca2+指示劑(GECIs)即可檢測；

3、膜泡融合/胞外分泌。胞質(zhì)Ca2+水平升高觸發(fā)易于釋放的突觸囊泡的胞外排泄，這些突觸囊泡充滿了神經(jīng)遞質(zhì)。在胞外分泌過程中，當突觸囊泡與質(zhì)膜融合時，細胞外介質(zhì)(pH ~ 7.4)中和囊泡腔(pH ~ 5.5)的酸性pH值，這種中和作用可以通過pH值指標探針檢測，如pHluorin；

4、神經(jīng)遞質(zhì)傳遞。一旦神經(jīng)遞質(zhì)被釋放到突觸，它們的功能根據(jù)遞質(zhì)類型而異，可以通過神經(jīng)遞質(zhì)(NT)指標檢測，如iAChSnFR和 dLight?；蚓幋a型乙酰膽堿(ACh)探針iAChSnFR用于檢測不同生物樣品中的ACh瞬變。它被設(shè)計成在膽堿結(jié)合時發(fā)出熒光，并被證實可用于測量小鼠體內(nèi)獎勵活動中海馬ACh傳遞的反應(yīng)。dLight是一種基于受體的遺傳編碼多巴胺(DA)熒光探針。它是通過用環(huán)狀排列的綠色熒光蛋白(cpGFP)取代DA受體(DAR)的第三個胞內(nèi)環(huán)（Intracellular Loop 3，ICL3）的位置而構(gòu)建的。dLight產(chǎn)生不同的熒光強度對應(yīng)于DA與DAR的結(jié)合量。

圖1所示：光纖記錄系統(tǒng)原理和基因編碼熒光探針。

A.光纖記錄裝置和信號處理的原理圖。在該模型中，將基因編碼的熒光探針病毒注射到腹側(cè)被蓋區(qū)(VTA)，投射的信號從伏隔核(NAc)和前額皮質(zhì)(PFC)記錄下來。

B.四種不同的基因編碼型探針及其對應(yīng)的神經(jīng)傳遞分子信號的示意圖表示。隨著動作電位(AP)的傳播，電壓門控鈣(Ca2+)通道被觸發(fā)打開，導(dǎo)致快速的Ca2+內(nèi)流；隨即誘導(dǎo)突觸囊泡的胞吐，突觸囊泡將神經(jīng)遞質(zhì)(NTs)釋放到突觸間隙，在突觸間隙中神經(jīng)遞質(zhì)可以與相應(yīng)的受體結(jié)合并激活突觸后神經(jīng)元，這些分子特征可以通過電壓指標(GEVIs) ，Ca2+探針(GECIs)， pH值指標探針(如pHluorin)，NT指標探針(G protein-coupled受體,GCPR)進行檢測。示意圖非真實比例。

光纖記錄實驗操作較為簡便，目前在神經(jīng)環(huán)路分子機制探究上應(yīng)用越發(fā)廣泛，同時越來越多的實驗室將光纖記錄與其他實驗技術(shù)進行聯(lián)合應(yīng)用。

1、光纖記錄與光遺傳

光遺傳學(xué)是一種以光作為工具特異性激活或抑制神經(jīng)傳遞的方法。研究人員經(jīng)常使用光遺傳學(xué)以極大的時間精確度來研究確定的神經(jīng)元亞群對特定行為的影響。但是光照的作用僅僅通過動物行為的檢測評估是不完善的，很有可能存在“假陽性”和“假陰性”，且不能排除自然行為的干擾。而光纖記錄即可提供足夠的證據(jù)支撐。光遺傳學(xué)結(jié)合光纖記錄的方法使研究人員能夠研究特定細胞、它們的投射關(guān)系的功能意義。

2、光纖記錄與核磁

一般認為，血氧水平檢測(BOLD) fMRI(功能性磁共振成像)通過血管耦合機制與神經(jīng)傳遞在時空上相關(guān)。為了更深入地了解神經(jīng)元對BOLD信號的貢獻，電生理學(xué)技術(shù)已被納入功能磁共振成像研究。雖然這些研究提供了關(guān)于神經(jīng)元環(huán)路更具體的信息，但功能磁共振成像(fMRI)所需要的磁場會在電生理信號中產(chǎn)生偽影。

而近幾年的研究中將光纖記錄和fMRI相結(jié)合，證明了Ca2+峰值和不同大腦區(qū)域的BOLD信號之間的聯(lián)系，同時有文獻證明星形膠質(zhì)細胞Ca2+水平的變化與BOLD信號也有關(guān)聯(lián)。fMRI技術(shù)與光纖記錄相結(jié)合，使fMRI掃描具有細胞分辨率。這種綜合技術(shù)有潛力闡明單個神經(jīng)元亞群對大腦回路的貢獻。

圖2所示：將BOLD fMRI技術(shù)與細胞-特異性病毒傳遞的GCaMP6（一種遺傳編碼的鈣指示劑，GECI）的光學(xué)檢測技術(shù)相結(jié)合（Schlegel et al .,Nature protocols(2018)）

3、光纖記錄與電生理

目前，電生理學(xué)是研究行為與自由行為動物體內(nèi)神經(jīng)元動力學(xué)關(guān)系的金標準分析技術(shù)。電生理學(xué)允許同時記錄數(shù)百或數(shù)千個細胞、離子通道和神經(jīng)元活動，電極可以落在單個細胞上，記錄細胞內(nèi)信號變化，或者落在細胞外空間，監(jiān)測整個大腦區(qū)域的電生理信號。它測量的電信號（電流或電位）以高時間分辨率的毫秒級離子通量導(dǎo)出。

電極陣列記錄來自電極尖端附近所有細胞的信號，不能直接區(qū)分細胞種類。由于光纖記錄方法缺乏較高的時間分辨率，在體電生理學(xué)缺乏細胞類型特異性，二者結(jié)合有助于高時空分辨率下研究不同的大腦區(qū)域特定環(huán)路和行為狀態(tài)。

R820三色光纖記錄系統(tǒng)，可記錄GCaMP、dLight等綠色熒光指示劑或遞質(zhì)探針，及RCaMP、jrGECO1a等紅色指示劑或遞質(zhì)探針信號，同時特有的410nm光源用于獲取對照信號，有效排除噪聲。靈活的TTL信號輸入輸出設(shè)置，更方便拓展實驗應(yīng)用。

R820三色多通道光纖記錄系統(tǒng)

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