光纖記錄（Fiber photometry）通過(guò)時(shí)間相關(guān)單光子計(jì)數(shù)(TCSPC)的光纖光學(xué)來(lái)測(cè)量熒光分子在大腦中發(fā)出的光信號(hào)?；诨驹恚褂弥睆捷^小的光纖探頭就能實(shí)現(xiàn)傳輸并收集熒光信號(hào)，將采集到的發(fā)射信號(hào)通過(guò)二色鏡進(jìn)行光譜分離，并通過(guò)濾波器聚焦到探測(cè)器上，即可檢測(cè)出熒光的實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)變化。

所以光纖記錄方法的優(yōu)勢(shì)主要在于：

1. 植入的光纖探頭體積小且柔韌性好，使得周圍組織損傷較??；

2. 因?yàn)橹踩牍饫w體積小，方便同時(shí)記錄多個(gè)大腦區(qū)域的信號(hào)；

3. 基于TCSPC的光纖是檢測(cè)發(fā)射光的超靈敏工具，滿足在低強(qiáng)度激發(fā)光下即可檢測(cè)熒光，從而減少了光漂白的機(jī)會(huì)，并延長(zhǎng)了記錄時(shí)間。

目前光纖記錄常用于檢測(cè)鈣信號(hào)及神經(jīng)遞質(zhì)信號(hào)變化，背后原理是通過(guò)給實(shí)驗(yàn)動(dòng)物注射基因編碼型的熒光探針/生物傳感器，隨后通過(guò)光纖記錄即可檢測(cè)到對(duì)應(yīng)神經(jīng)信號(hào)的變化?；蚓幋a生物傳感器是一類生物分子信號(hào)介質(zhì)，它被整合到細(xì)胞的基因組中，然后由細(xì)胞的分子機(jī)制產(chǎn)生。這些蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)可以被設(shè)計(jì)成在化學(xué)物質(zhì)存在或細(xì)胞環(huán)境變化時(shí)改變構(gòu)象，從而產(chǎn)生熒光信號(hào)。

常見的基因編碼型的生物傳感器根據(jù)應(yīng)用場(chǎng)景主要分為：

1、膜去極化。一旦動(dòng)作電位(AP)被激活，AP將沿軸突向下傳播，并使突觸前鈕扣對(duì)應(yīng)的膜去極化(從?65 mV到+40 mV或更大)。這種膜去極化作為神經(jīng)元激活的分子特征，可以通過(guò)遺傳編碼的電壓指示探針(GEVIs)檢測(cè)；

2、電壓門控Ca2+通道激活和輸入。當(dāng)膜去極化發(fā)生在突觸前活躍區(qū)，電壓門控Ca2+通道打開，導(dǎo)致Ca2+快速內(nèi)流。這種升高的細(xì)胞質(zhì)Ca2+濃度(從~100-~400nM)的變化可以持續(xù)約50-150毫秒，通過(guò)基因編碼Ca2+指示劑(GECIs)即可檢測(cè)；

3、膜泡融合/胞外分泌。胞質(zhì)Ca2+水平升高觸發(fā)易于釋放的突觸囊泡的胞外排泄，這些突觸囊泡充滿了神經(jīng)遞質(zhì)。在胞外分泌過(guò)程中，當(dāng)突觸囊泡與質(zhì)膜融合時(shí)，細(xì)胞外介質(zhì)(pH ~ 7.4)中和囊泡腔(pH ~ 5.5)的酸性pH值，這種中和作用可以通過(guò)pH值指標(biāo)探針檢測(cè)，如pHluorin；

4、神經(jīng)遞質(zhì)傳遞。一旦神經(jīng)遞質(zhì)被釋放到突觸，它們的功能根據(jù)遞質(zhì)類型而異，可以通過(guò)神經(jīng)遞質(zhì)(NT)指標(biāo)檢測(cè)，如iAChSnFR和 dLight。基因編碼型乙酰膽堿(ACh)探針iAChSnFR用于檢測(cè)不同生物樣品中的ACh瞬變。它被設(shè)計(jì)成在膽堿結(jié)合時(shí)發(fā)出熒光，并被證實(shí)可用于測(cè)量小鼠體內(nèi)獎(jiǎng)勵(lì)活動(dòng)中海馬ACh傳遞的反應(yīng)。dLight是一種基于受體的遺傳編碼多巴胺(DA)熒光探針。它是通過(guò)用環(huán)狀排列的綠色熒光蛋白(cpGFP)取代DA受體(DAR)的第三個(gè)胞內(nèi)環(huán)（Intracellular Loop 3，ICL3）的位置而構(gòu)建的。dLight產(chǎn)生不同的熒光強(qiáng)度對(duì)應(yīng)于DA與DAR的結(jié)合量。

圖1所示：光纖記錄系統(tǒng)原理和基因編碼熒光探針。

A.光纖記錄裝置和信號(hào)處理的原理圖。在該模型中，將基因編碼的熒光探針病毒注射到腹側(cè)被蓋區(qū)(VTA)，投射的信號(hào)從伏隔核(NAc)和前額皮質(zhì)(PFC)記錄下來(lái)。

B.四種不同的基因編碼型探針及其對(duì)應(yīng)的神經(jīng)傳遞分子信號(hào)的示意圖表示。隨著動(dòng)作電位(AP)的傳播，電壓門控鈣(Ca2+)通道被觸發(fā)打開，導(dǎo)致快速的Ca2+內(nèi)流；隨即誘導(dǎo)突觸囊泡的胞吐，突觸囊泡將神經(jīng)遞質(zhì)(NTs)釋放到突觸間隙，在突觸間隙中神經(jīng)遞質(zhì)可以與相應(yīng)的受體結(jié)合并激活突觸后神經(jīng)元，這些分子特征可以通過(guò)電壓指標(biāo)(GEVIs) ，Ca2+探針(GECIs)， pH值指標(biāo)探針(如pHluorin)，NT指標(biāo)探針(G protein-coupled受體,GCPR)進(jìn)行檢測(cè)。示意圖非真實(shí)比例。

光纖記錄實(shí)驗(yàn)操作較為簡(jiǎn)便，目前在神經(jīng)環(huán)路分子機(jī)制探究上應(yīng)用越發(fā)廣泛，同時(shí)越來(lái)越多的實(shí)驗(yàn)室將光纖記錄與其他實(shí)驗(yàn)技術(shù)進(jìn)行聯(lián)合應(yīng)用。

1、光纖記錄與光遺傳

光遺傳學(xué)是一種以光作為工具特異性激活或抑制神經(jīng)傳遞的方法。研究人員經(jīng)常使用光遺傳學(xué)以極大的時(shí)間精確度來(lái)研究確定的神經(jīng)元亞群對(duì)特定行為的影響。但是光照的作用僅僅通過(guò)動(dòng)物行為的檢測(cè)評(píng)估是不完善的，很有可能存在“假陽(yáng)性”和“假陰性”，且不能排除自然行為的干擾。而光纖記錄即可提供足夠的證據(jù)支撐。光遺傳學(xué)結(jié)合光纖記錄的方法使研究人員能夠研究特定細(xì)胞、它們的投射關(guān)系的功能意義。

2、光纖記錄與核磁

一般認(rèn)為，血氧水平檢測(cè)(BOLD) fMRI(功能性磁共振成像)通過(guò)血管耦合機(jī)制與神經(jīng)傳遞在時(shí)空上相關(guān)。為了更深入地了解神經(jīng)元對(duì)BOLD信號(hào)的貢獻(xiàn)，電生理學(xué)技術(shù)已被納入功能磁共振成像研究。雖然這些研究提供了關(guān)于神經(jīng)元環(huán)路更具體的信息，但功能磁共振成像(fMRI)所需要的磁場(chǎng)會(huì)在電生理信號(hào)中產(chǎn)生偽影。

而近幾年的研究中將光纖記錄和fMRI相結(jié)合，證明了Ca2+峰值和不同大腦區(qū)域的BOLD信號(hào)之間的聯(lián)系，同時(shí)有文獻(xiàn)證明星形膠質(zhì)細(xì)胞Ca2+水平的變化與BOLD信號(hào)也有關(guān)聯(lián)。fMRI技術(shù)與光纖記錄相結(jié)合，使fMRI掃描具有細(xì)胞分辨率。這種綜合技術(shù)有潛力闡明單個(gè)神經(jīng)元亞群對(duì)大腦回路的貢獻(xiàn)。

圖2所示：將BOLD fMRI技術(shù)與細(xì)胞-特異性病毒傳遞的GCaMP6（一種遺傳編碼的鈣指示劑，GECI）的光學(xué)檢測(cè)技術(shù)相結(jié)合（Schlegel et al .,Nature protocols(2018)）

3、光纖記錄與電生理

目前，電生理學(xué)是研究行為與自由行為動(dòng)物體內(nèi)神經(jīng)元?jiǎng)恿W(xué)關(guān)系的金標(biāo)準(zhǔn)分析技術(shù)。電生理學(xué)允許同時(shí)記錄數(shù)百或數(shù)千個(gè)細(xì)胞、離子通道和神經(jīng)元活動(dòng)，電極可以落在單個(gè)細(xì)胞上，記錄細(xì)胞內(nèi)信號(hào)變化，或者落在細(xì)胞外空間，監(jiān)測(cè)整個(gè)大腦區(qū)域的電生理信號(hào)。它測(cè)量的電信號(hào)（電流或電位）以高時(shí)間分辨率的毫秒級(jí)離子通量導(dǎo)出。

電極陣列記錄來(lái)自電極尖端附近所有細(xì)胞的信號(hào)，不能直接區(qū)分細(xì)胞種類。由于光纖記錄方法缺乏較高的時(shí)間分辨率，在體電生理學(xué)缺乏細(xì)胞類型特異性，二者結(jié)合有助于高時(shí)空分辨率下研究不同的大腦區(qū)域特定環(huán)路和行為狀態(tài)。

R820三色光纖記錄系統(tǒng)，可記錄GCaMP、dLight等綠色熒光指示劑或遞質(zhì)探針，及RCaMP、jrGECO1a等紅色指示劑或遞質(zhì)探針信號(hào)，同時(shí)特有的410nm光源用于獲取對(duì)照信號(hào)，有效排除噪聲。靈活的TTL信號(hào)輸入輸出設(shè)置，更方便拓展實(shí)驗(yàn)應(yīng)用。

R820三色多通道光纖記錄系統(tǒng)

免費(fèi)試用

識(shí)別上方二維碼，快來(lái)申請(qǐng)?jiān)囉冒?/p>

一、光纖記錄工作原理

人類的大腦擁有約900億個(gè)神經(jīng)元，神經(jīng)元之間通過(guò)突觸相互連接形成了復(fù)雜的神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)，并由此產(chǎn)生各種復(fù)雜的功能。大腦能夠合成和釋放上百種神經(jīng)遞質(zhì)，神經(jīng)信號(hào)通過(guò)突觸釋放的神經(jīng)遞質(zhì)從而在神經(jīng)元之間進(jìn)行傳遞（圖1）。

圖1

當(dāng)神經(jīng)興奮傳導(dǎo)到突觸末端時(shí)，會(huì)刺激突觸上鈣離子通道打開促使鈣離子大量?jī)?nèi)流，胞內(nèi)鈣離子濃度瞬時(shí)上升，驅(qū)動(dòng)突觸小泡將神經(jīng)遞質(zhì)釋放到突觸間隙中，釋放出的神經(jīng)遞質(zhì)隨即與突觸后膜上的受體結(jié)合，將遞質(zhì)信號(hào)傳遞給下一個(gè)神經(jīng)元，從而進(jìn)行信息的逐級(jí)傳遞（圖2）。這些神經(jīng)元以復(fù)雜的通路投射到多個(gè)腦區(qū)，產(chǎn)生了學(xué)習(xí)認(rèn)知、情感、控制、動(dòng)機(jī)、獎(jiǎng)勵(lì)等豐富的功能。光纖記錄系統(tǒng)則可以通過(guò)檢測(cè)鈣離子和神經(jīng)遞質(zhì)的熒光變化程度來(lái)表征群體神經(jīng)元的活動(dòng)情況。

圖2

那么光纖記錄是如何檢測(cè)神經(jīng)活動(dòng)的呢？

以鈣離子熒光信號(hào)檢測(cè)為例，光纖記錄系統(tǒng)的技術(shù)原理是借助鈣離子濃度變化與神經(jīng)元活動(dòng)之間的嚴(yán)格對(duì)應(yīng)關(guān)系，利用特殊的熒光染料或者蛋白質(zhì)熒光探針，將神經(jīng)元中鈣離子的濃度通過(guò)熒光強(qiáng)度表現(xiàn)出來(lái)，并被光纖記錄系統(tǒng)捕捉，從而達(dá)到檢測(cè)神經(jīng)元活動(dòng)的目的。

在神經(jīng)系統(tǒng)中，靜息狀態(tài)時(shí)神經(jīng)元胞內(nèi)鈣離子濃度為50-100nM，而在神經(jīng)元興奮時(shí)胞內(nèi)鈣離子濃度能上升10-100倍，因此我們可以通過(guò)注射鈣離子基因編碼指示劑（Calcium indicator，如GCaMPs、RCaMPs等）來(lái)標(biāo)記鈣離子。鈣離子指示劑帶有熒光蛋白（如GFP、RFP等）及其變異體的蛋白質(zhì)，可與鈣調(diào)蛋白（CaM）和肌球蛋白輕鏈激酶M13域結(jié)合（圖3左）。當(dāng)神經(jīng)活動(dòng)增強(qiáng)時(shí)鈣離子通道打開，大量鈣離子內(nèi)流并與CaM結(jié)合，導(dǎo)致M13和CaM結(jié)構(gòu)域相互作用，引發(fā)cpEGFP結(jié)構(gòu)重排，從而增強(qiáng)綠色熒光信號(hào)（圖3 右）。

因此我們可以通過(guò)檢測(cè)鈣信號(hào)的變化來(lái)表征神經(jīng)元的活動(dòng)，進(jìn)而研究神經(jīng)元活動(dòng)與動(dòng)物行為的相關(guān)性，探究復(fù)雜行為背后的調(diào)控機(jī)制。

圖3

(Marisela Morales, et al. Neuron, 2020)

圖4：VTA-VGluT2神經(jīng)元編碼先天逃避反應(yīng)

光纖記錄檢測(cè)神經(jīng)遞質(zhì)信號(hào)的原理與上述方法相同，把cpEGFP嵌入特定的神經(jīng)遞質(zhì)受體，受體與神經(jīng)遞質(zhì)結(jié)合后會(huì)引發(fā)受體構(gòu)象改變并發(fā)出熒光信號(hào)（圖5）。通過(guò)病毒注射、轉(zhuǎn)染等技術(shù)手段，可以將這種可遺傳編碼的探針表達(dá)在細(xì)胞或小鼠腦部，借助成像技術(shù)，觀察神經(jīng)遞質(zhì)濃度的實(shí)時(shí)變化。

圖5

(Yulong Li, et al. Cell, 2018)

圖6：條件反射實(shí)驗(yàn)中伏隔核Nac腦區(qū)的DA釋放

二、光纖記錄實(shí)驗(yàn)方法

在光纖記錄實(shí)驗(yàn)中，首先要選擇合適的熒光病毒。熒光染料或指示劑是通過(guò)病毒載體轉(zhuǎn)入目標(biāo)腦區(qū)，常用載體為AAV病毒。根據(jù)實(shí)驗(yàn)的不同，需要選擇特異啟動(dòng)子或者Cre-FloxP系統(tǒng)來(lái)特異標(biāo)記目標(biāo)神經(jīng)元，無(wú)特異性的GCaMPs表達(dá)雖然可以觀測(cè)群體神經(jīng)元活動(dòng)但無(wú)神經(jīng)元特異性，光纖記錄的作用在于觀測(cè)特異類型神經(jīng)元群體的活動(dòng)。

實(shí)驗(yàn)流程：

1、在目標(biāo)腦區(qū)注射鈣熒光病毒，并在注射位點(diǎn)埋植光纖插針，用于收集熒光；

圖7：病毒注射與陶瓷插針埋植

2、待2-3周鈣熒光病毒表達(dá)后，連接光纖，使用光纖記錄系統(tǒng)采集動(dòng)物在行為學(xué)實(shí)驗(yàn)中大腦的鈣熒光信號(hào)；

圖8：病毒表達(dá)

3、通過(guò)分析軟件處理鈣熒光信號(hào)數(shù)據(jù)，并結(jié)合行為學(xué)視頻對(duì)動(dòng)物的行為進(jìn)行分析。

圖9：光纖記錄結(jié)合高架十字迷宮實(shí)驗(yàn)

三、光纖記錄數(shù)據(jù)分析

以瑞沃德R820三色光纖記錄系統(tǒng)記錄的數(shù)據(jù)為例。

1、數(shù)據(jù)預(yù)處理。R820三色光纖記錄系統(tǒng)軟件集信號(hào)采集與數(shù)據(jù)分析于一體，在數(shù)據(jù)分析中，數(shù)據(jù)預(yù)處理過(guò)程包含平滑處理，基線矯正，運(yùn)動(dòng)矯正等功能。

平滑處理可以將數(shù)據(jù)中的過(guò)多雜信號(hào)去除，最大限度的突出目標(biāo)peak?；€矯正多數(shù)針對(duì)的是熒光信號(hào)因長(zhǎng)時(shí)間記錄導(dǎo)致漂白信號(hào)逐步下降，或者光纖的自發(fā)熒光在長(zhǎng)期記錄下逐步被漂白基線逐步下降等情況。此情形的數(shù)據(jù)因?yàn)檎w呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，不利于后續(xù)數(shù)據(jù)作圖分析，所以需要進(jìn)行基線矯正。運(yùn)動(dòng)矯正用于采用410nm對(duì)照通道的數(shù)據(jù)，410nm數(shù)據(jù)可以用于反應(yīng)背景噪音信號(hào)，運(yùn)動(dòng)矯正即將410nm數(shù)據(jù)與470nm數(shù)據(jù)進(jìn)行擬合，通過(guò)算法從470數(shù)據(jù)中去除410nm數(shù)據(jù)的波動(dòng)，得到真實(shí)的熒光數(shù)據(jù)。

圖10：光纖記錄數(shù)據(jù)預(yù)處理

2. 將熒光數(shù)據(jù)與動(dòng)物行為數(shù)據(jù)同步對(duì)比，選擇事件標(biāo)記或者增加事件標(biāo)記，事件相關(guān)信號(hào)分析作圖。

圖11：事件分析

3. 將不同組的數(shù)據(jù)進(jìn)行組間對(duì)比，即可分析不同處理因素下熒光數(shù)據(jù)的差異。此外，還可結(jié)合行為學(xué)視頻同步分析動(dòng)物的運(yùn)動(dòng)軌跡。

圖12：不同數(shù)據(jù)組間分析

通過(guò)以上步驟，原始的熒光數(shù)據(jù)就可以直接出圖啦。

光纖記錄實(shí)驗(yàn)的工作原理，實(shí)驗(yàn)方法以及數(shù)據(jù)分析已經(jīng)全部講完啦….

想體驗(yàn)R820三色多通道光纖記錄系統(tǒng)

識(shí)別下方二維碼，即可免費(fèi)試 用

讓實(shí)驗(yàn)信號(hào)更強(qiáng)更準(zhǔn)

熱分解工藝一般分為直燃(TO)、蓄熱燃燒(RTO)、催化燃燒(CO)、蓄熱催化燃燒(RCO)4種，只是燃燒方式和換熱方式的兩兩不同組合，主要可以用于處理吸附濃縮氣，也可以用于直接處理廢氣濃度＞3.5g/m3的中高濃度廢氣。

1）TO是將高濃廢氣送入燃燒室直接燃燒(燃燒室內(nèi)一般有一股長(zhǎng)明火)，廢氣中有機(jī)物在750℃以上燃燒生成CO2和水，高溫燃燒氣通過(guò)換熱器與新進(jìn)廢氣間接換熱后排掉，換熱效率一般≤60%導(dǎo)致運(yùn)行成本很高，只在少數(shù)能有效利用排放余熱或有副產(chǎn)燃?xì)獾钠髽I(yè)中應(yīng)用。

2）RTO的燃燒方式與TO相同，只是將換熱器改為蓄熱陶瓷，高溫燃燒氣與新進(jìn)廢氣交替進(jìn)入蓄熱陶瓷直接換熱，熱量利用率可提高到90%以上，理念先進(jìn)，運(yùn)行成本較低，是目前國(guó)家主推的廢氣治理工藝。

3）CO是采用貴重金屬催化劑降低廢氣中有機(jī)物與O2的反應(yīng)活化能，使得有機(jī)物可以在250～350℃較低的溫度就能充分氧化生成CO2和H2O，屬無(wú)焰燃燒，高溫氧化氣通過(guò)換熱器與新進(jìn)廢氣間接換熱后排掉，熱量利用率一般≤75%，常用于處理吸附劑再生脫附出來(lái)的高濃廢氣。

4）RCO燃燒方式與CO相同，換熱方式與RTO相同，由于投資堪比RTO，能處理的廢氣種類受催化劑影響又比RTO少，所以很少用企業(yè)采用RCO工藝。熱分解以RTO和CO的應(yīng)用例子較多，如果用于處理吸附脫附的濃縮氣，兩者差別不大，但若直接處理中高濃度廢氣時(shí)有很大區(qū)別，需要企業(yè)認(rèn)真對(duì)待。

 RTO與CO在處理中高濃度廢氣中各方面的異同

現(xiàn)就廢氣適用種類、廢氣濃度、廢氣流量、輔助能源、儀表自控、安全風(fēng)險(xiǎn)、環(huán)保風(fēng)險(xiǎn)、動(dòng)力負(fù)荷、主設(shè)備投資、運(yùn)行成本等方面進(jìn)行比較。

2.1廢氣適用種類

兩種工藝都可以用于處理烷烴、芳香烴、酮、醇、酯、醚、部分含氮化合物等有機(jī)廢氣。含硫磷類廢氣會(huì)使催化劑中毒，不適合用CO處理，而如果忽略含硫磷廢氣燃燒時(shí)對(duì)設(shè)備儀表的少量腐蝕，可以限制性的使用RTO處理。

由于處理溫度均＜1150℃，兩種工藝都不能用于處理含鹵代烴廢氣以避免產(chǎn)生二噁英。部分類似硅烷類的廢氣因?yàn)槿紵笊傻墓腆w塵灰會(huì)堵塞催化劑或蓄熱陶瓷或切換閥密封面，所以RTO和CO都不能使用。

含漆霧粉塵類廢氣要預(yù)過(guò)濾以避免切換閥關(guān)不緊、蓄熱體阻塞等現(xiàn)象，RTO的預(yù)處理要過(guò)濾到至少F6級(jí)；而CO處理廢氣主流通道上無(wú)切換閥，加上可以采用讓廢氣流速較高粉塵不易結(jié)存、定期給整個(gè)系統(tǒng)升溫回火將粉塵剝離分解等方法，因此CO的預(yù)處理只需簡(jiǎn)單過(guò)濾到G4級(jí)。

此外，因?yàn)楹鬃跃塾袡C(jī)物(如丁二烯、丙烯酸酯等)廢氣會(huì)影響到切換閥的有效開閉，同時(shí)也可能在位于廢氣進(jìn)口處的蓄熱體上低溫沉積，使用RTO處理該類廢氣時(shí)會(huì)有安全隱患，而CO則不受影響。

在日常膜片鉗實(shí)驗(yàn)時(shí)，你是否也被這些問(wèn)題困擾？

操作十分復(fù)雜，一不小心就出錯(cuò)

注意事項(xiàng)多，包括如何排除噪音、提高封接成功率等等

想要借鑒該領(lǐng)域?qū)＜医?jīng)驗(yàn)，一直苦尋不到……

8月23日（周二）19：00，「大成學(xué)堂」特邀南京大學(xué)張洋潯博士做客直播間，為大家?guī)?lái)“膜片鉗技術(shù)解析與經(jīng)驗(yàn)分享”。通過(guò)本次直播課程，你可以收獲膜片鉗技術(shù)的詳細(xì)解析、多年實(shí)驗(yàn)操作經(jīng)驗(yàn)、日常操作注意事項(xiàng)等方面的專業(yè)知識(shí)，還可在線提問(wèn)獲得詳細(xì)解答。 

張洋潯 博士

南京大學(xué)博士，致力于研究?jī)?nèi)源性神經(jīng)遞質(zhì)/調(diào)質(zhì)系統(tǒng)及外源性藥物對(duì)前庭代償?shù)挠绊懠吧窠?jīng)機(jī)制，擅長(zhǎng)應(yīng)用全細(xì)胞膜片鉗記錄、環(huán)路示蹤、光/化學(xué)遺傳學(xué)操控方法、光纖記錄等實(shí)驗(yàn)技術(shù)。相關(guān)研究成果發(fā)表在Journal of Neuroscience, Biomedicine & Pharmacotherapy, Neuroscience Bulletin等學(xué)術(shù)期刊。

8月23日（周二）19：00

相約直播間，輕松掌握膜片鉗技術(shù)

↑↑碼上預(yù)約，快來(lái)免費(fèi)報(bào)名

你在進(jìn)行光纖記錄實(shí)驗(yàn)時(shí)，是否有如下煩腦：

◆ 記錄好的數(shù)據(jù)看著很雜亂，不知如何整理？

◆ 數(shù)據(jù)處理包含哪些步驟？

◆ 如何確定數(shù)據(jù)分析的baseline

◆ ΔF/F指的是什么？

◆ 信號(hào)出現(xiàn)了“漂白效應(yīng)”怎么辦？

無(wú)需困惑，對(duì)以上問(wèn)題，我們最近總結(jié)了一份實(shí)操步驟，這份操作指南可幫你迅速上手?jǐn)?shù)據(jù)處理

常見光纖記錄數(shù)據(jù)處理過(guò)程

讓我們來(lái)看一張?jiān)紨?shù)據(jù)案例圖，下圖顯示數(shù)據(jù)整體波動(dòng)過(guò)于密集，其中410nm對(duì)照通道數(shù)據(jù)不夠穩(wěn)定；對(duì)應(yīng)事件標(biāo)記（線條標(biāo)記處）的peak也不是很突出，針對(duì)這種數(shù)據(jù)情況，我們立刻開始數(shù)據(jù)處理吧。

（▲本文實(shí)操分析案例圖）

（*以下分析過(guò)程以瑞沃德雙色多通道光纖記錄系統(tǒng)操作界面為主要示例）

01.第 一步

我們將數(shù)據(jù)根據(jù)需要分析的時(shí)間段進(jìn)行裁剪，此步驟也可跳過(guò)。

02.第二步

數(shù)據(jù)預(yù)處理。常見數(shù)據(jù)預(yù)處理過(guò)程包含平滑處理，基線矯正，運(yùn)動(dòng)矯正。平滑處理可以將數(shù)據(jù)中的過(guò)多雜信號(hào)去除，ZD限度的突出目標(biāo)peak。如下圖所示，原始數(shù)據(jù)經(jīng)平滑處理后目標(biāo)peak更加突出，更容易觀察分析。

基線矯正多數(shù)針對(duì)的是熒光信號(hào)因長(zhǎng)時(shí)間記錄導(dǎo)致漂白信號(hào)逐步下降，或者光纖的自發(fā)熒光在長(zhǎng)期記錄下逐步被漂白基線逐步下降等情況。此情形的數(shù)據(jù)因?yàn)檎w呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，不利于后續(xù)數(shù)據(jù)作圖分析，所以需要進(jìn)行基線矯正。如下圖所示，基線矯正可以直接將下降趨勢(shì)的數(shù)據(jù)通過(guò)算法擬合后恢復(fù)成平整狀態(tài)。

運(yùn)動(dòng)矯正用于采用410nm對(duì)照通道的數(shù)據(jù)，410nm數(shù)據(jù)可以用于反應(yīng)背景噪音信號(hào)，運(yùn)動(dòng)矯正即將410nm數(shù)據(jù)與470nm數(shù)據(jù)進(jìn)行擬合，通過(guò)算法從470數(shù)據(jù)中去除410nm數(shù)據(jù)的波動(dòng)，得到真實(shí)的熒光數(shù)據(jù)。當(dāng)不選擇運(yùn)動(dòng)矯正功能或者實(shí)驗(yàn)未記錄410nm的數(shù)據(jù)，可以選擇一定時(shí)間范圍內(nèi)的信號(hào)作為對(duì)照進(jìn)行算法處理。

03.第三步

數(shù)據(jù)預(yù)處理后即可得到整體數(shù)據(jù)的ΔF/F或者Z-score，用于反應(yīng)數(shù)據(jù)的波動(dòng)幅度。二者采用了不同的算法，數(shù)據(jù)的呈現(xiàn)結(jié)果略有不同。

ΔF/F=（F-F1）/F0：

（1）當(dāng)數(shù)據(jù)進(jìn)行基線矯正后：

◆ 若對(duì)照選擇為410，F(xiàn)1=fitted410，F(xiàn)0=median（raw data）

◆ 若對(duì)照選擇非410：F1為基線矯正曲線值，F(xiàn)0=median（Baseline）

（2）當(dāng)數(shù)據(jù)未進(jìn)行基線矯正：

◆ 若數(shù)據(jù)對(duì)照為410，則F1=F0=fitted410，

◆ 若數(shù)據(jù)對(duì)照非410，則F1=F0=median（Baseline）

Z-score：

使用標(biāo)準(zhǔn)分?jǐn)?shù)計(jì)算方式，即z-score=（x-mean）/std，x=ΔF/F，mean為ΔF/F的均值，std為相應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)差。

04.第四步

將熒光數(shù)據(jù)與動(dòng)物行為數(shù)據(jù)同步對(duì)比，選擇事件標(biāo)記或者增加事件標(biāo)記。

05.第五步

選擇事件分析的時(shí)間區(qū)間和baseline區(qū)間，用于事件相關(guān)信號(hào)分析作圖。

06.第六步

將不同組的數(shù)據(jù)進(jìn)行組間對(duì)比，即可分析不同處理因素下熒光數(shù)據(jù)的差異。

通過(guò)以上步驟，原始的熒光數(shù)據(jù)就可以直接出圖啦。

空軍軍醫(yī)大學(xué)光纖記錄系統(tǒng)培訓(xùn)現(xiàn)場(chǎng)

（▲瑞沃德雙色多通道光纖記錄系統(tǒng)）（▲瑞沃德雙色多通道光纖記錄系統(tǒng)）

福利時(shí)間

如果你想要體驗(yàn)操作

同款光纖記錄系統(tǒng)開展實(shí)驗(yàn)

識(shí)別下方二維碼

即可申請(qǐng)免費(fèi)SY喲▼

做蛋白研究的小伙伴都知道，一個(gè)完整的Western Blot包括了很多個(gè)步驟，從蛋白提取到配膠、上樣電泳，再到轉(zhuǎn)膜、封閉，Z后孵育一抗二抗后才能去進(jìn)行檢測(cè)。時(shí)間跨度非常長(zhǎng)，而且這中間的每一步都包含了很多的小細(xì)節(jié)，稍有不慎就會(huì)導(dǎo)致結(jié)果出錯(cuò)，然后又得從頭來(lái)過(guò)。所以，關(guān)于WB，幾乎每一位經(jīng)驗(yàn)豐富的實(shí)驗(yàn)老手都有著一本厚厚的血淚史。

今天，小編就帶領(lǐng)大家簡(jiǎn)要梳理一遍WB流程中的一些細(xì)節(jié)，避免因某一環(huán)節(jié)出現(xiàn)差錯(cuò)而導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)重做。

Tips：更多干貨分享可掃描下方二維碼回看直播

一：樣品的獲取與制備

一般來(lái)說(shuō)我們檢測(cè)的樣品主要為細(xì)胞或者是組織，制備過(guò)程中盡量保持低溫。其次在制備時(shí)一定要根據(jù)目的蛋白的特性選擇合適的裂解液，比如對(duì)膜蛋白的提取、胞漿蛋白的提取和組織蛋白的提取等。

二：配膠、上樣及蛋白電泳

配置凝膠時(shí)一定要將膠板清洗干凈，用ddH2O或者無(wú)水乙醇潤(rùn)洗。晾干后根據(jù)蛋白分子量進(jìn)行不同濃度凝膠配制。上樣時(shí)需對(duì)蛋白進(jìn)行煮沸變性，如果進(jìn)行定量分析一定要將所有蛋白上樣量調(diào)至相同。電泳時(shí)低壓（80V）跑濃縮膠，高壓（120v）跑分離膠，至溴酚藍(lán)即將跑出膠面時(shí)終止電泳。

三：轉(zhuǎn)膜及封閉

轉(zhuǎn)膜時(shí)需提前配置好轉(zhuǎn)膜液并低溫放置。關(guān)于印跡膜來(lái)說(shuō)，目前大多實(shí)驗(yàn)室用的是PVDF膜，根據(jù)目的蛋白大小選擇合適的孔徑，大于20KDa的蛋白選用0.45μm的膜，小于20KDa的蛋白選用0.2μm的膜。PVDF膜在使用時(shí)需用甲醇處理活化膜上的正電基團(tuán)，使其更容易與帶負(fù)電的蛋白結(jié)合。轉(zhuǎn)膜時(shí)一定要注意膜和凝膠的正反問(wèn)題，除此之外一定要注意凝膠和轉(zhuǎn)印膜間不要留有氣泡。封閉液可選擇5%的BSA或5%的脫脂奶粉，可以室溫封閉1-2h或者4℃過(guò)夜封閉。封閉時(shí)一定要注意對(duì)磷酸化的抗體或生物素標(biāo)記的抗體不能用脫脂奶粉封閉膜，只能用5%BSA。

四：抗體的孵育和檢測(cè)

一抗二抗的選擇一定要注意種屬來(lái)源問(wèn)題，如果這一步出錯(cuò)那前面的努力就相當(dāng)于白費(fèi)了。檢測(cè)方法可以選擇靈敏度超高的化學(xué)發(fā)光方法或者現(xiàn)在比較流行的熒光WB法。相較于傳統(tǒng)的化學(xué)發(fā)光方法，熒光WB能夠?qū)崿F(xiàn)更jing準(zhǔn)的定量，還可以進(jìn)行多重檢測(cè)，只需要將不同的目的蛋白標(biāo)記上不同的熒光就可以了。基于目前各大期刊雜志對(duì)WB發(fā)表的要求，全蛋白定量是一種新的趨勢(shì)，熒光WB同樣可以實(shí)現(xiàn)全蛋白歸一化。

Azure600多功能分子成像如何幫助您獲得定量WB數(shù)據(jù)

? Azure600可同時(shí)在一張印跡膜上進(jìn)行4通道熒光成像 ，同時(shí)也具有高靈敏化學(xué)發(fā)光檢測(cè)功能，靈敏度可達(dá)fg級(jí)。

? Azure600近紅外采用激光光源，激發(fā)強(qiáng)度大，單色性好，減少光泄漏，在更短的時(shí)間內(nèi)達(dá)到更好的信噪比，Western Blotjing準(zhǔn)定量的金標(biāo)準(zhǔn)。

? Azure600配合AzureRed總蛋白熒光染色劑可以做總蛋白歸一化和定量三個(gè)靶標(biāo)蛋白，生成可以信賴的定量Western Blot數(shù)據(jù)。

? Azure600標(biāo)配9.1MP的高分辨CCD，動(dòng)態(tài)范圍可達(dá)4.8OD，保證結(jié)果的準(zhǔn)確性。

? Azure600可做彩色Marker與化學(xué)發(fā)光條帶的自動(dòng)整合，分子量查看更直觀。

? Azure600提供原始數(shù)據(jù)16bit的tiff圖給到期刊，這里的tiff原始數(shù)據(jù)是指未經(jīng)裁剪，像素修改，對(duì)比度調(diào)整等任何操作的圖，保證結(jié)果的真實(shí)性和可靠性。

Azure600除了進(jìn)行熒光印跡膜，化學(xué)發(fā)光印跡膜檢測(cè)外，還可以進(jìn)行普通凝膠成像，EMSA檢測(cè)，菌落篩選，小動(dòng)物成像，植物成像等。