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  教學的規(guī)劃 2007-10-31 00:00:00

  [1] PCR引物設計的原則 引物設計有3 條基本原則：首先引物與模板的序列要緊密互補，其次引物與引物之間避免形成穩(wěn)定的二聚體或發(fā)夾結構，再次引物不能在模板的非目的位點引發(fā)DNA 聚合反應(即錯配)。 具體實現(xiàn)這3 條基本原則需要考慮到諸多因素，如引物長度（primer length），產(chǎn)物長度（product length），序列Tm 值(melting temperature)，引物與模板形成雙鏈的內(nèi)部穩(wěn)定性(internal stability， 用∆G 值反映)，形成引物二聚體(primer dimer)及發(fā)夾結構（duplex formation and hairpin）的能值，在錯配位點（false priming site）的引發(fā)效率，引物及產(chǎn)物的GC 含量（composition），等等。必要時還需對引物進行修飾，如增加限制性內(nèi)切酶位點，引進突變等。根據(jù)有關參考資料和筆者在實踐中的總結，引物設計應注意如下要點： 1. 引物的長度一般為15-30 bp，常用的是18-27 bp，但不應大于38，因為過長會導致其延伸溫度大于74℃，不適于Taq DNA 聚合酶進行反應[2]。 2. 引物序列在模板內(nèi)應當沒有相似性較高，尤其是3’端相似性較高的序列，否則容易導致錯配。引物3’端出現(xiàn)3 個以上的連續(xù)堿基，如GGG 或CCC，也會使錯誤引發(fā)機率增加[2]。 3. 引物3’端的末位堿基對Taq 酶的DNA 合成效率有較大的影響。不同的末位堿基在錯配位置導致不同的擴增效率，末位堿基為A 的錯配效率明顯高于其他3 個堿基，因此應當避免在引物的3’端使用堿基A[3][4]。另外，引物二聚體或發(fā)夾結構也可能導致PCR 反應失敗。5’端序列對PCR 影響不太大，因此常用來引進修飾位點或標記物[2]。 4. 引物序列的GC 含量一般為40-60%，過高或過低都不利于引發(fā)反應。上下游引物的GC含量不能相差太大[2][5]。 5. 引物所對應模板位置序列的Tm 值在72℃左右可使復性條件Z佳。Tm 值的計算有多種方法，如按公式Tm＝4(G+C)＋2(A+T)，在Oligo 軟件中使用的是Z鄰近法(the nearest neior method) [6][7]。 6. ∆G 值是指DNA 雙鏈形成所需的自由能，該值反映了雙鏈結構內(nèi)部堿基對的相對穩(wěn)定性。應當選用3’端∆G 值較低（值不超過9），而5’端和中間∆G 值相對較高的引物。引物的3’端的∆G 值過高，容易在錯配位點形成雙鏈結構并引發(fā)DNA 聚合反應[6]。 7. 引物二聚體及發(fā)夾結構的能值過高（超過4.5kcal/mol）易導致產(chǎn)生引物二聚體帶，并且降低引物有效濃度而使PCR 反應不能正常進行[8]。 8. 對引物的修飾一般是在5’端增加酶切位點，應根據(jù)下一步實驗中要插入PCR 產(chǎn)物的載體的相應序列而確定。 值得一提的是，各種模板的引物設計難度不一。有的模板本身條件比較困難，例如GC含量偏高或偏低，導致找不到各種指標都十分合適的引物；在用作克隆目的的PCR 因為產(chǎn)物序列相對固定，引物設計的選擇自由度較低。在這種情況只能退而求其次，盡量去滿足條件。 [2] 擴增較大片段DNA的PCR方法 一般PCR方法在擴增大片段DNA時的局限性： 通常所用的PCR方法都在兩個方面有局限，即目標產(chǎn)物精確程度和合成片段的大小。Pfu(Pyrococcus furiosus)DNA聚合酶，具有完整的3'外切酶校讀活性（3'-editing-exonuclease），可以將每個循環(huán)中堿基的錯配率由10*-4降到10*-3，從而提高PCR產(chǎn)物的準確性。但它在擴增1.5-2.0kb片段時，效率比Klentaq l(Taq DNA聚酶N-末端缺失突變體，類似于E.coli DNA聚合酶I Klenow片段）或AmpliTaq（全長的Taq DNA聚合酶）等聚合酶差；在擴增5.0-7.0kb片段時亦不比各種形式的Taq DNA聚合酶（如Ampli Taq、Klentaq 1、Klentaq 5等N-末端缺失的變異株）有明顯優(yōu)越之處。因而以往的PCR反應產(chǎn)物限制在5.0kb以內(nèi)。超出這一范圍，PCR擴增反應效率將明顯下降，同時產(chǎn)物會降解。即使將延伸時間定為30分鐘（10倍于通常所需）亦無改進。 利用兩種DNA聚合酶進行較大片段DNA的擴增 美國華盛頓大學醫(yī)學院的Barnes WM等對前述問題進行了深入系統(tǒng)的研究，認為：PCR反應效率低Z主要的原因是由于錯配的堿基阻礙了延伸反應的正常進行，Pfu DNA聚合酶雖然可以通過“校讀”功能糾正錯配的堿基，但亦可能降解引物，尤其是在較長反應時間下；酶濃度較高時，反應效果更差。因此必需將Pfu DNA聚合酶的濃度控制在較低狀態(tài)，同時配合使用Klentaq l等DNA聚合酶，這樣既可以有效地去除錯配，又可以使Klentaq l等催化的延伸反應順暢進行。實驗證實，按15:1 的比例混合使用Klentaq l和Pfu DNA聚合酶，引物大小為27-33nt，即可使反應有效進行。當然，對于各種不同條件的反應，兩種類型酶的Z佳配比需要具體考慮。 控制脫嘌呤反應增強擴增效率 在PCR反應體系中某些成分耐熱性較差，會影響反應效率。DNA聚合酶的熱穩(wěn)定性一般都是較好的，可能是模板DNA在溫度較高的環(huán)境中某些位點發(fā)生脫嘌呤反應從而阻礙反應的順利進行。Lindahl和Nyberg的研究結果顯示：在70℃ pH7.4的條件下， 單鏈DNA脫嘌 呤反應的速度是雙鏈DNA的4倍；100℃ pH7.0時，100kb的堿基中每分鐘將有1個位點脫嘌呤。這一反應與緩沖體系中酸堿度的變化有關。人們注意到：三羥甲基氨基甲烷（Tris）的酸解離常數(shù)（pKa）會隨溫度升高而改變，平均每升高1℃，pKa值降低0.03。因而，在25℃時pH8.55的PCR反應體系，到95℃熱變性時，pH值將變?yōu)?.45，這就很可能誘導脫嘌呤反應。 為了解決這一問題，可以采取下列措施： 縮短熱變性時間，Barnes等在擴增35kb的大片段時，變性條件為95℃5秒，取得滿意結果； 盡可能使升溫、 降溫過程縮短，可選擇使用導熱性能優(yōu)越的薄壁反應管及較為先進的擴增設備； 適當提高反應體系的pH值，反應Z初應控制在pH8.8-9.2范圍； 適當增加延伸時間（可長至20分鐘）。使用這種方法可以擴增Z大為35kb的DNA片段，產(chǎn)物的準確性亦有充分保證，克服了以往基因克隆過程中出現(xiàn)的DNA分子內(nèi)的堿基重排和可能的毒性危險等問題。 [3] PCR常見問題 PCR產(chǎn)物的電泳檢測時間 一般為48h以內(nèi)，有些Z好于當日電泳檢測，大于48h后帶型不規(guī)則甚致消失。 假陰性，不出現(xiàn)擴增條帶 PCR反應的關鍵環(huán)節(jié)有①模板核酸的制備，②引物的質量與特異性，③酶的質量及， ④PCR循環(huán)條件。尋找原因亦應針對上述環(huán)節(jié)進行分析研究。 模板：①模板中含有雜蛋白質，②模板中含有Taq酶YZ劑，③模板中蛋白質沒有消 化除凈，特別是染色體中的組蛋白，④在提取制備模板時丟失過多，或吸入酚。⑤模 板核酸變性不徹底。在酶和引物質量好時，不出現(xiàn)擴增帶，極有可能是標本的消化處 理，模板核酸提取過程出了毛病，因而要配制有效而穩(wěn)定的消化處理液，其程序亦應 固定不宜隨意更改。 酶失活：需更換新酶，或新舊兩種酶同時使用，以分析是否因酶的活性喪失或不夠而 導致假陰性。需注意的是有時忘加Taq酶或溴乙錠。 引物：引物質量、引物的濃度、兩條引物的濃度是否對稱，是PCR失敗或擴增條帶不 理想、容易彌散的常見原因。有些批號的引物合成質量有問題，兩條引物一條濃度 高，一條濃度低，造成低效率的不對稱擴增，對策為：①選定一個好的引物合成單 位。②引物的濃度不僅要看OD值，更要注重引物原液做瓊脂糖凝膠電泳，一定要有 引物條帶出現(xiàn)，而且兩引物帶的亮度應大體一致，如一條引物有條帶，一條引物無條 帶，此時做PCR有可能失敗，應和引物合成單位協(xié)商解決。如一條引物亮度高，一條 亮度低，在稀釋引物時要平衡其濃度。③引物應高濃度小量分裝保存，防止多次凍融 或長期放冰箱冷藏部分，導致引物變質降解失效。④引物設計不合理，如引物長度不 夠，引物之間形成二聚體等。 Mg2+濃度：Mg2+離子濃度對PCR擴增效率影響很大，濃度過高可降低PCR擴增的特 異性，濃度過低則影響PCR擴增產(chǎn)量甚至使PCR擴增失敗而不出擴增條帶。 反應體積的改變：通常進行PCR擴增采用的體積為20ul、30ul、50ul?；?00ul，應用多 大體積進行PCR擴增，是根據(jù)科研和臨床檢測不同目的而設定，在做小體積如20ul 后，再做大體積時，一定要模索條件，否則容易失敗。 物理原因：變性對PCR擴增來說相當重要，如變性溫度低，變性時間短，極有可能出 現(xiàn)假陰性;退火溫度過低，可致非特異性擴增而降低特異性擴增效率退火溫度過高影 響引物與模板的結合而降低PCR擴增效率。有時還有必要用標準的溫度計，檢測一下 擴增儀或水溶鍋內(nèi)的變性、退火和延伸溫度，這也是PCR失敗的原因之一。 靶序列變異：如靶序列發(fā)生突變或缺失，影響引物與模板特異性結合，或因靶序列某 段缺失使引物與模板失去互補序列，其PCR擴增是不會成功的。 假陽性 出現(xiàn)的PCR擴增條帶與目的靶序列條帶一致，有時其條帶更整齊，亮度更高。 引物設計不合適：選擇的擴增序列與非目的擴增序列有同源性，因而在進行PCR擴增 時，擴增出的PCR產(chǎn)物為非目的性的序列。靶序列太短或引物太短，容易出現(xiàn)假陽 性。需重新設計引物。 靶序列或擴增產(chǎn)物的交叉污染：這種污染有兩種原因：一是整個基因組或大片段的交 叉污染，導致假陽性。這種假陽性可用以下方法解決：①操作時應小心輕柔，防止 將靶序列吸入加樣槍內(nèi)或濺出離心管外。②除酶及不能耐高溫的物質外，所有試劑或 器材均應高壓消毒。所用離心管及樣進槍頭等均應一次性使用。③必要時，在加標本 前，反應管和試劑用紫外線照射，以破壞存在的核酸。二是空氣中的小片段核酸污 染，這些小片段比靶序列短，但有一定的同源性。可互相拼接，與引物互補后，可擴 增出PCR產(chǎn)物，而導致假陽性的產(chǎn)生，可用巢式PCR方法來減輕或消除。 出現(xiàn)非特異性擴增帶 PCR擴增后出現(xiàn)的條帶與預計的大小不一致，或大或小，或者同時出現(xiàn)特異性擴增帶 與非特異性擴增帶。非特異性條帶的出現(xiàn)，其原因：一是引物與靶序列不完全互補、 或引物聚合形成二聚體。二是Mg2+離子濃度過高、退火溫度過低，及PCR循環(huán)次數(shù) 過多有關。其次是酶的質和量，往往一些來源的酶易出現(xiàn)非特異條帶而另一來源的酶 則不出現(xiàn)，酶量過多有時也會出現(xiàn)非特異性擴增。其對策有：①必要時重新設計引 物。②減低酶量或調換另一來源的酶。③降低引物量，適當增加模板量，減少循環(huán)次 數(shù)。④適當提高退火溫度或采用二溫度點法(93℃變性，65℃左右退火與延伸)。 出現(xiàn)片狀拖帶或涂抹帶 PCR擴增有時出現(xiàn)涂抹帶或片狀帶或地毯樣帶。其原因往往由于酶量過多或酶的質量 差，dNTP濃度過高，Mg2+濃度過高，退火溫度過低，循環(huán)次數(shù)過多引起。其對策有：①減少酶量，或調換另一來源的酶。②減少dNTP的濃度。③適當降低Mg2+濃 度。④增加模板量，減少循環(huán)次數(shù)。 克隆PCR產(chǎn)物 1)克隆PCR產(chǎn)物的Z優(yōu)條件是什么？ Z佳插入片段：載體比需實驗確定。1：1（插入片段：載體）常為Z佳比，摩爾數(shù)比1：8或8：1也行。應測定比值范圍。連接用5ul 2X連接液， 50ng質粒DNA，1Weiss單位的T4連接酶，插入片段共10ul。室溫保溫1小時，或4oC過夜。在這2種溫度下，缺T-凸出端的載體會自連，產(chǎn)生藍斑。室溫保溫1小時能滿足大多數(shù)克隆要求，為提高連接效率，需4oC過夜。 2)PCR產(chǎn)物是否需要用凝膠純化？ 如凝膠分析擴增產(chǎn)物只有一條帶，不需要用凝膠純化。如可見其他雜帶，可能是積累了大量引物的二聚體。少量的引物二聚體的摩爾數(shù)也很高，這會產(chǎn)生高比例的帶有引物二聚體的克隆，而非目的插入片段。為此需在克隆前做凝膠純化。 3)如果沒有回收到目的片段，還需要作什么對照實驗？ A）涂布未轉化的感受態(tài)細胞。 如有菌落，表明氨芐失效，或污染上帶有氨芐抗型的質粒，或產(chǎn)生氨芐抗型的菌落。 B）轉化完整質粒，計算菌落生長數(shù)，測定轉化效率。 例如，將1ug/ul質粒1:100稀釋，1ul用于100ul感受態(tài)細胞轉化。用SOC稀釋到1000ul后，用100ul鋪板。培養(yǎng)過夜，產(chǎn)生1000個菌落。轉化率為： 產(chǎn)生菌落的總數(shù)/鋪板DNA的總量。 鋪板DNA的總量是轉化反應所用的量除以稀釋倍數(shù)。具體而言轉化用10ng DNA，用SOC稀釋到1000u后含10 ng DNA，用1/10鋪板，共用1 ng DNA。轉化率為： 1000克隆X10（3次方） ng /鋪板1 ng DNA ug=10（6次方）cfu/ ug 轉化pGEM-T應用10（8次方）cfu/ ug感受態(tài)細胞 如沒有菌落或少有菌落，感受態(tài)細胞的轉化率太低。 C）如用pGEM-T正對照，或PCR產(chǎn)物，產(chǎn)生>20-40藍斑（用指定步驟10（8次方）cfu/ ug感受態(tài)細胞），表明載體失去T。可能是連接酶污染了核酸酶。T4 DNA連接酶（M1801，M1804，M1794）質量標準好無核酸酶污染，不應用其它來源的T4 DNA連接酶替換。 D）用pGEM-T或pGEM-T Easy載體，連接pGEM-T正對照，轉化高頻率感受態(tài)細胞（10（8次方）cfu/ug），按照指定的實驗步驟，可得100個菌落，其中60%應為白斑，如產(chǎn)生>20-40藍斑， 沒有菌落或少有菌落，連接有問題。 4)對照實驗結果好，卻沒有回收到目的片段，實驗出了什么問題？ A）連接用室溫保溫1小時，能滿足大多數(shù)克隆，為提GX率，需4oC過夜。 B）插入片段帶有污染，使3`-T缺失，或YZ連接，YZ轉化。為此，將插入片段和pGEM-T正對照混合，再連接。如降低了對照的菌落數(shù)，插入片段需純化，或重新制備。如產(chǎn)生大量的藍斑，插入片段污染有核酸酶，使pGEM-T或pGEM-T Easy載體3`-T缺失。 C）插入片段不適于連接。用凝膠純化的插入片段，因受UV過度照射，時有發(fā)生。UV過度照射會產(chǎn)生嘧啶二聚體，不利于連接，DNA必需重新純化。 D）帶有修復功能的耐熱DNA聚合酶的擴增產(chǎn)物末端無A，后者是pGEM-T或pGEM-T Easy載體克隆所需。加Taq DNA聚合酶和核苷酸可在末端加A。詳情查pGEM-T pGEM-T Easy載體技術資料（TM042）。 E）高度重復序列可能會不穩(wěn)定，在擴增中產(chǎn)生缺失和重排，如發(fā)現(xiàn)插入片段高頻率地產(chǎn)生缺失和重排，需用重組缺陷大腸桿菌菌株，如SURE細胞。 PCR反應體系與反應條件 標準的PCR反應體系： 10×擴增緩沖液 10ul 4種dNTP混合物 各200umol/L 引物 各10～100pmol 模板DNA 0.1～2ug Taq DNA聚合酶 2.5u Mg2+ 1.5mmol/L 加雙或三蒸水至 100ul PCR反應五要素： 參加PCR反應的物質主要有五種即引物、酶、dNTP、模板和Mg2+ 引物： 引物是PCR特異性反應的關鍵，PCR 產(chǎn)物的特異性取決于引物與模板DNA互補的程度。理論上，只要知道任何一段模板DNA序列， 就能按其設計互補的寡核苷酸鏈做引物，利用PCR就可將模板DNA在體外大量擴增。 設計引物應遵循以下原則： ①引物長度： 15-30bp，常用為20bp左右。 ②引物擴增跨度： 以200-500bp為宜，特定條件下可擴增長至10kb的片段。 ③引物堿基：G+C含量以40-60%為宜，G+C太少擴增效果不佳，G+C過多易出現(xiàn)非特異條帶。ATGCZ好隨機分布，避免5個以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列。 ④避免引物內(nèi)部出現(xiàn)二級結構，避免兩條引物間互補，特別是3'端的互補，否則會形成引物二聚體，產(chǎn)生非特異的擴增條帶。 ⑤引物3'端的堿基，特別是Z末及倒數(shù)第二個堿基，應嚴格要求配對，以避免因末端堿基不配對而導致PCR失敗。 ⑥引物中有或能加上合適的酶切位點， 被擴增的靶序列Z好有適宜的酶切位點， 這對酶切分析或分子克隆很有好處。 ⑦引物的特異性：引物應與核酸序列數(shù)據(jù)庫的其它序列無明顯同源性。引物量： 每條引物的濃度0.1～1umol或10～100pmol，以Z低引物量產(chǎn)生所需要的結果為好，引物濃度偏高會引起錯配和非特異性擴增，且可增加引物之間形成二聚體的機會。 酶及其濃度 目前有兩種Taq DNA聚合酶供應， 一種是從棲熱水生桿菌中提純的天然酶，另一種為大腸菌合成的基因工程酶。催化一典型的PCR反應約需酶量2。5U(指總反應體積為100ul時)，濃度過高可引起非特異性擴增，濃度過低則合成產(chǎn)物量減少。 dNTP的質量與濃度 dNTP的質量與濃度和PCR擴增效率有密切關系，dNTP粉呈顆粒狀，如保存不當易變性失去生物學活性。dNTP溶液呈酸性，使用時應配成高濃度后，以1M NaOH或1M Tris。HCL的緩沖液將其PH調節(jié)到7.0～7.5，小量分裝， -20℃冰凍保存。多次凍融會使dNTP降解。在PCR反應中，dNTP應為50～200umol/L，尤其是注意4種dNTP的濃度要相等( 等摩爾配制)，如其中任何一種濃度不同于其它幾種時(偏高或偏低)，就會引起錯配。濃度過低又會降低PCR產(chǎn)物的產(chǎn)量。dNTP能與Mg2+結合，使游離的Mg2+濃度降低。 模板(靶基因)核酸 模板核酸的量與純化程度，是PCR成敗與否的關鍵環(huán)節(jié)之一，傳統(tǒng)的DNA純化方法通常采用SDS和蛋白酶K來消化處理標本。SDS的主要功能是： 溶解細胞膜上的脂類與蛋白質，因而溶解膜蛋白而破壞細胞膜，并解離細胞中的核蛋白，SDS 還能與蛋白質結合而沉淀； 蛋白酶K能水解消化蛋白質，特別是與DNA結合的組蛋白，再用有機溶劑酚與氯仿抽提掉蛋白質和其它細胞組份，用乙醇或異丙醇沉淀核酸。提取的核酸即可作為模板用于PCR反應。一般臨床檢測標本，可采用快速簡便的方法溶解細胞，裂解病原體，消化除去染色體的蛋白質使靶基因游離，直接用于PCR擴增。RNA模板提取一般采用異硫氰酸胍或蛋白酶K法，要防止RNase降解RNA。 Mg2+濃度 Mg2+對PCR擴增的特異性和產(chǎn)量有顯著的影響，在一般的PCR反應中，各種dNTP濃度為200umol/L時，Mg2+濃度為1.5～2.0mmol/L為宜。Mg2+濃度過高，反應特異性降低，出現(xiàn)非特異擴增，濃度過低會降低Taq DNA聚合酶的活性，使反應產(chǎn)物減少。 PCR反應條件的選擇 PCR反應條件為溫度、時間和循環(huán)次數(shù)。 溫度與時間的設置： 基于PCR原理三步驟而設置變性-退火-延伸三個溫度點。在標準反應中采用三溫度點法，雙鏈DNA在90～95℃變性，再迅速冷卻至40 ～60℃，引物退火并結合到靶序列上，然后快速升溫至70～75℃，在Taq DNA 聚合酶的作用下，使引物鏈沿模板延伸。對于較短靶基因(長度為100～300bp時)可采用二溫度點法， 除變性溫度外、退火與延伸溫度可合二為一，一般采用94℃變性，65℃左右退火與延伸(此溫度Taq DNA酶仍有較高的催化活性)。 ①變性溫度與時間：變性溫度低，解鏈不完全是導致PCR失敗的Z主要原因。一般情況下，93℃～94℃lmin足以使模板DNA變性，若低于93℃則需延長時間，但溫度不能過高，因為高溫環(huán)境對酶的活性有影響。此步若不能使靶基因模板或PCR產(chǎn)物完全變性，就會導致PCR失敗。 ②退火(復性)溫度與時間：退火溫度是影響PCR特異性的較重要因素。變性后溫度快速冷卻至40℃～60℃，可使引物和模板發(fā)生結合。由于模板DNA 比引物復雜得多，引物和模板之間的碰撞結合機會遠遠高于模板互補鏈之間的碰撞。退火溫度與時間，取決于引物的長度、堿基組成及其濃度，還有靶基序列的長度。對于20個核苷酸，G+C含量約50%的引物，55℃為選擇Z適退火溫度的起點較為理想。引物的復性溫度可通過以下公式幫助選擇合適的溫度： Tm值(解鏈溫度)=4(G+C)＋2(A+T) 復性溫度=Tm值-(5～10℃) 在Tm值允許范圍內(nèi)， 選擇較高的復性溫度可大大減少引物和模板間的非特異性結合， 提高PCR反應的特異性。復性時間一般為30～60sec，足以使引物與模板之間完全結合。 ③延伸溫度與時間：Taq DNA聚合酶的生物學活性： 70～80℃ 150核苷酸/S/酶分子 70℃ 60核苷酸/S/酶分子 55℃ 24核苷酸/S/酶分子 高于90℃時， DNA合成幾乎不能進行。 PCR反應的延伸溫度一般選擇在70～75℃之間，常用溫度為72℃，過高的延伸溫度不利于引物和模板的結合。PCR延伸反應的時間，可根據(jù)待擴增片段的長度而定，一般1Kb以內(nèi)的DNA片段，延伸時間1min是足夠 的。3～4kb的靶序列需3～4min；擴增10Kb需延伸至15min。延伸進間過長會導致非特異性擴增帶的出現(xiàn)。對低濃度模板的擴增，延伸時間要稍長些。

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