小膠質(zhì)細胞是髓系細胞，在介導(dǎo)神經(jīng)系統(tǒng) (CNS) 中的炎性反應(yīng)方面起重要作用。在其他任務(wù)中，小膠質(zhì)細胞負責(zé)識別和消除外來入侵者，并修復(fù)由損傷引起的局部 CNS 組織損害。小膠質(zhì)細胞受體-接頭蛋白復(fù)合體 [稱為骨 髓細胞 2 表達的觸發(fā)受體 (TREM2) 和 12 kDa DNAX 激活蛋白 (DAP12)] 的功能經(jīng)證實在 AD 和帕金森病等多種神經(jīng)退行性疾病中非常重要。TREM2 和 DAP12 之間的相互作用很可能介導(dǎo)與吞噬和碎片清除、促炎性細胞因子產(chǎn)生和釋放的調(diào)節(jié)，以及促進小膠質(zhì)細胞增殖和存活的轉(zhuǎn)錄變化有關(guān)的多種神經(jīng)炎性反應(yīng)。因此，TREM2/DAP12 功能變化直接影響小膠質(zhì)細胞激活的時間和程度，從而影響神經(jīng)元功能和存活。

TREM2 是一種跨膜糖蛋白，由胞外免疫球蛋白樣結(jié)構(gòu)域、跨膜結(jié)構(gòu)域和胞質(zhì)部分，其中胞質(zhì)部分與 DAP12 結(jié)合，起到信號轉(zhuǎn)導(dǎo)功能。TREM2 有來自病原體的外源配體，還有暫時尚未明確的內(nèi)源配體。胞外配體結(jié)合會激活 TREM2，這反過來會激活 DAP12，從而導(dǎo)致胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)事件發(fā)生級聯(lián)反應(yīng)。具體而言，DAP12 包含一個基于免疫受體酪氨酸的激活基序 (ITAM)，其中酪氨酸殘基在 TREM2 結(jié)合配體時會被磷酸化。然后這會募集 Syk 激酶來激活下游信號轉(zhuǎn)導(dǎo)分子。

本文采用了 TREM2-/- 的小鼠對 TREM2 在脂質(zhì)代謝以及 TREM2 缺失引起的小膠質(zhì)細胞的膽固醇堆積的來源進行了探討。發(fā)現(xiàn)TREM2在小膠質(zhì)細胞脂質(zhì)代謝過程中的重要作用以及myelin是膽固醇堆積的重要來源。TREM2 正常表達的動物和細胞在 TREM2 收到激活后，可以引起 DAP12 的自磷酸化，進一步招募 SYK 蛋白并將其磷酸化，激活 SYK 信號通路，激活下游的 DAM 和脂類代謝的基因，從而將小膠紙細胞吞噬的 myelin 膽固醇正常代謝為自由化的膽固醇。本文前期的大量的細胞實驗和動物實驗都驗證了 TREM2 的功能，同時也構(gòu)建了SYK的磷酸化檢測平臺，通過 ALPHA surefire ultra 的技術(shù)對 SYK 的磷酸化水平進行定量分析。

ALPHA surefire ultra技術(shù)是珀金埃爾默公司基于ALPHA平臺開發(fā)出的細胞磷酸化檢測工具。新的 AlphaLISA Surefire Ultra 采用成熟的 CaptSureTM 技術(shù)代替 Protein A，不僅實現(xiàn)了試劑盒抗體捕獲的特異性，而且具有更低的檢測背景。新的試劑盒利用 AlphaLISA 受體微珠代替 AlphaScreen 受體微珠，對血紅蛋白淬滅干擾具有更加出色的光譜特性。ALPHA 檢測本身非常簡單。

ALPHA surefire Ultra 平臺的特點：

步驟簡單，減少時間和人工

細胞樣本經(jīng)過刺激、裂解后，只需要將試劑組分加入裂解液，無需任何多余的洗滌步驟。

高靈敏度及定量化檢測

檢測靈敏度大于等于 Western Blot 方法；可以檢測過表達蛋白靶點及內(nèi)源水平表達的蛋白；可以使用穩(wěn)定表達細胞系或原代細胞及干細胞進行試驗。

高Z'值和信號窗口

可以獲得更高的信噪比、更低的cv以及更穩(wěn)定的assay。

通量高的同時上樣量少

可以兼容 96、384 或 1536 孔板的不同檢測模式，適合于微孔板樣品，樣品只需 5uL 或以下的體積。

本文中將 TREM2 和 DAP12 共同表達在 293T 細胞中共同表達，以此為平臺使用不同的脂類和蛋白類物質(zhì)進行刺激，然后檢測其 Syk 的磷酸化水平的變化。

珀金埃爾默同時提供Phospho-Syk (Tyr352)和total Syk檢測試劑盒。

同時 ALPHA Z新的技術(shù)也支持磷酸化蛋白和總蛋白同時檢測：

Phospho-Syk (Tyr352)和total Syk檢測試劑盒

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Phospho-Syk (Tyr352)

total Syk

另外還有Syk的下游激活的PI3K、ERK、NFκB等信號通路，根據(jù)具體環(huán)境，這些信號轉(zhuǎn)導(dǎo)級聯(lián)可差異性和協(xié)同性參與，從而影響各種小膠質(zhì)細胞功能，包括受體介導(dǎo)的吞噬、β-catenin 和 mTOR 復(fù)合體 1 介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄調(diào)控、通過 PIP 2/3 介導(dǎo)的 AKT 和 mTOR 復(fù)合體 2 激活實現(xiàn)的代謝平衡、導(dǎo)致促炎性分子轉(zhuǎn)錄調(diào)控的 RAS/MEK/ERK 激活，以及導(dǎo)致肌動蛋白重構(gòu)的鈣調(diào)節(jié)。除了這些信號通路以外神經(jīng)退行性疾病也會導(dǎo)致 Tau 蛋白等的磷酸化水平發(fā)生變化。這些變化都可以通過 ALPHA surefire ultra 的平臺進行定量檢測。

同時珀金埃爾默公司還提供高品質(zhì)的 ALPHA Assay 檢測設(shè)備：

EnVision多標(biāo)記微孔板讀板儀

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EnSight多標(biāo)記微孔板讀板儀

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Victor Nivo多標(biāo)記微孔板讀板儀

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在淀粉樣蛋白斑中，TREM2 是小膠質(zhì)細胞的吞噬功能的關(guān)鍵。本文還進行了 Myelin 被小膠質(zhì)細胞的吞噬實驗，該實驗采用Opera Phenix HCS System和 HarmonyHCA Software 進行自動化拍攝和定量分析。

Opera Phenix 高內(nèi)涵系統(tǒng)

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