抗體-藥物偶聯(lián)物（ADC）作為一種生物ZL候選藥物是近年來(lái)的研究熱點(diǎn)。ADC藥物是將單克隆抗體的腫瘤特異性和靶向性與GX的小分子藥物的細(xì)胞毒性結(jié)合成一個(gè)新的藥物分子，從而形成有效的kang癌ZL劑。這些分子由三部分組成：?jiǎn)慰寺】贵w、穩(wěn)定的連接物以及細(xì)胞毒性小分子藥物。

ADC藥物的藥效和清除率都與藥物抗體偶聯(lián)比（DAR）值有關(guān)，因此在藥物開(kāi)發(fā)過(guò)程中必須對(duì)其精確分析。尺寸排阻色譜法和疏水色譜法是在天然生理?xiàng)l件下檢測(cè)DAR的兩種最常用的方法。

在本應(yīng)用中，我們通過(guò)SEC-MS和HIC-UV法來(lái)對(duì)一個(gè)半胱氨酸偶聯(lián)的ADC藥物模擬物進(jìn)行分析。該模擬物是由LC-SMCC交聯(lián)劑將丹磺酰基螢光團(tuán)共價(jià)鍵合到IgG1-mAb上，形成一個(gè)載藥量不同（0-8）的抗體混合物。

圖1. 半胱氨酸偶聯(lián)的ADC模擬物

圖2. 半胱氨酸偶聯(lián)的ADC的異質(zhì)性

實(shí)驗(yàn)部分

在SEC-MS方法中，我們選用TSKgel SuperSW3000尺寸排阻色譜柱。將ADC注入該色譜柱中，HPLC系統(tǒng)與質(zhì)譜相連，用于檢測(cè)DAR譜圖。從譜圖中觀察到，每個(gè)主峰之間的分子量差異為1336 Da，對(duì)應(yīng)兩個(gè)丹磺?；鶡晒鈭F(tuán)分子的分子量。SEC/MS分析表明，平均DAR為3.9 。

圖3. ADC模擬物的SEC/MS譜圖

然后，使用疏水色譜柱TSKgel Butyl-NPR和UV檢測(cè)，來(lái)確認(rèn)DAR分布情況。mAb抗體結(jié)合的藥物分子數(shù)越多，ADC的疏水性越大，在HIC固定相上的保留時(shí)間更長(zhǎng)，載藥量不同的組分便可得到分離。從DAR譜圖中可以看到，DAR=0-8的各峰之間分離情況很好。

圖4. ADC模擬物的HIC-UV譜圖

結(jié)果與討論

SEC-MS和HIC-UV是有效表征ADC的DAR譜圖的兩種方法。在TSKgel SuperSW3000色譜柱上，使用了質(zhì)譜兼容的流動(dòng)相，通過(guò)高分辨率ESI-MS檢測(cè)，驗(yàn)證藥物模擬物中ADC組分的分子量。

HIC-UV方法中，使用TSKgel Butyl-NPR色譜柱對(duì)樣品中各種抗體-載荷的ADC異構(gòu)體進(jìn)行疏水性分析，進(jìn)一步確認(rèn)其DAR分布。結(jié)合這兩種分析方法，可以有效驗(yàn)證ADC生物大分子的DAR譜圖。

對(duì)微納器件進(jìn)行表征時(shí)，常關(guān)注的便是器件的表面形貌和三維尺寸信息，比如粗糙度、深度、體積等，這些都是評(píng)價(jià)微納加工工藝的重要指標(biāo)。然而，在進(jìn)行表面三維的分析工作中，我們可能常遇到這樣的苦惱：

　　光學(xué)明場(chǎng)無(wú)法直接定位到亞微米級(jí)缺陷結(jié)構(gòu)!

　　樣品結(jié)構(gòu)太復(fù)雜，微弱信號(hào)無(wú)法捕獲，難以準(zhǔn)確測(cè)量尺度信息!

　　三維接觸式測(cè)量經(jīng)常會(huì)損傷柔軟樣品，導(dǎo)致測(cè)試結(jié)果不準(zhǔn)確!

　　今天，友碩小編將從下面幾個(gè)角度來(lái)看看蔡司激光共聚焦顯微鏡如何幫助你更好地解決這些問(wèn)題。

　　失效分析：多尺度多維度原位分析!

　　器件表面往往存在一些特殊的結(jié)構(gòu)或缺陷，比如亞微米尺度的劃痕，這些特征難以在光學(xué)明場(chǎng)下被直接觀察到。C-DIC(圓微分干涉)觀察模式可以讓樣品表面亞微米尺度的微小起伏都可以呈現(xiàn)出浮雕效果，幫助我們快速定位并開(kāi)展下一步的分析工作。

　　▲ 不同觀察方式下晶圓表面缺陷

　　在定位到感興趣區(qū)域后，可以直接切換到共聚焦模式，進(jìn)行表面三維形貌掃描，并進(jìn)行尺寸測(cè)量及分析，無(wú)需轉(zhuǎn)移樣品即可完成樣品多尺度多維度的表征。

　　▲共聚焦三維圖像及深度測(cè)量

　　對(duì)于某些樣品，暗場(chǎng)和熒光模式也是一種很好定位方法，表面起伏的結(jié)構(gòu)在暗場(chǎng)下尤其明顯，如藍(lán)寶石這類(lèi)能發(fā)熒光的晶圓，利用熒光成像也能幫助我們快速地定位到失效結(jié)構(gòu)。甚至，共聚焦還可以和電鏡或者雙束電鏡(FIB)(點(diǎn)擊查看)實(shí)現(xiàn)原位關(guān)聯(lián)，在共聚焦顯微鏡下進(jìn)行定位后轉(zhuǎn)移樣品到電鏡下進(jìn)行更高分辨的表征分析。

　　深硅刻蝕：結(jié)構(gòu)深，信號(hào)弱，蔡司激光共聚焦顯微鏡有辦法!

　　深硅刻蝕的樣品通常為窄而深的溝壑結(jié)構(gòu)。接觸式測(cè)量(如臺(tái)階儀)無(wú)法接觸到溝壑底部測(cè)得信息，而由于結(jié)構(gòu)特殊造成了反射光信號(hào)損失，常規(guī)白光干涉或者顯微明場(chǎng)無(wú)法捕獲底面的微弱信號(hào)。因此，不得不對(duì)樣品進(jìn)行裂片分析，這不僅破壞了樣品，而且還使分析流程復(fù)雜化。

　　西湖大學(xué)張先鋒老師用蔡司激光共聚焦顯微鏡對(duì)深163.905 μm，寬3.734μm的刻蝕坑進(jìn)行成像，高靈敏探測(cè)器、大功率激光及Z Brightness Correction技術(shù)可以幫助成功檢測(cè)到底部的微弱信號(hào)，完成大深寬比(近50：1)樣品的三維形貌表征與測(cè)量，輕松實(shí)現(xiàn)無(wú)損檢測(cè)分析。

利用ACE鍵合相的固定相選擇

分離度方程式可以確定影響分離度的參數(shù)：柱效（N）、容量因子（k）和選擇性（α）。

在過(guò)去幾年里，柱效和使用超GX色譜柱（被稱(chēng)為“UHPLC”色譜柱）作為實(shí)現(xiàn)分離目標(biāo)的手段已得到了極大的重視。

UHPLC已通過(guò)更快速的分離和更快速的方法開(kāi)發(fā)提高實(shí)驗(yàn)室生產(chǎn)力來(lái)證明了其價(jià)值。

然而，選擇性往往被忽視，且其重要性也被強(qiáng)調(diào)柱效所掩蓋。這是令人遺憾的。

在影響分離度的三個(gè)參數(shù)中，選擇性是Z為重要的。

（參見(jiàn)圖1）通過(guò)利用柱效和選擇性，通?？梢詫?shí)現(xiàn)更好和更快的分離。

圖 1：N、α和k對(duì)分離度（Rs）的影響

提高N，α或k可以提高分離度（Rs）。

然而，從這些圖中可以看出，隨著N或k值的提高，對(duì)分離度的改善效果也逐漸降低。

另一方面，提高選擇性（α）則沒(méi)有這個(gè)問(wèn)題，因此其成為開(kāi)發(fā)分離方法時(shí)的Z佳優(yōu)化變量。

在反相色譜中，固定相與分析物之間存在多種相互作用的機(jī)制，這可以用來(lái)實(shí)現(xiàn)分離。

這些相互作用機(jī)制包括：疏水性結(jié)合、π-π、氫鍵、偶極-偶極和形狀選擇性。

不同類(lèi)型的鍵合相將提供其中一種或多種相互作用機(jī)制。表1列出了ACE鍵合相和每種可能的主要相互作用機(jī)制，這取決于分析物和流動(dòng)相條件。

表1: 比較不同鍵合相的分離機(jī)制/相互作用                                                                                    

利用鍵合相的選擇性實(shí)現(xiàn)更好的分離。
圖2表明了兩種ACE鍵合相即C18-AR與苯基之間的選擇性差異。
盡管兩種鍵合相提供了強(qiáng)π-π和偶極-偶極相互作用的可能性，但是在其它可能的相互作用機(jī)制（特別是疏水性結(jié)合）的強(qiáng)度方面，它們存在顯著差異。

C18-AR可能具有其它不同的分離機(jī)制，可以為復(fù)雜的混合物帶來(lái)更好的分離效果。對(duì)于其他混合物，可能不是這種情況，這是ACE鍵合相的優(yōu)勢(shì)。

當(dāng)開(kāi)發(fā)分離方法時(shí)，ACE鍵合相可以提供各種可供選擇的重要保留機(jī)制。

非常強(qiáng)大且獨(dú)特的C18-AR和C18-PFP相只有在ACE和ACE Excel色譜柱中可以獲得。
通過(guò)利用柱效和選擇性，可以實(shí)現(xiàn)更好的分離。

圖 2：C18-AR與苯基相之間選擇性差異的比較

色譜柱尺寸： 50 x 2.1 mm, 3 μm
流動(dòng)相：

A= 20mM KH2PO4,pH 2.7（溶于水中）；
B= 20mM KH2PO4,pH 2.7（溶于甲醇/水中：65:35, v/v）
流速： 0.6 mL/min
溫度： 60 ℃
檢測(cè)： UV 214 nm
梯度： 5分鐘內(nèi)從3至B，并持續(xù)1分鐘。

樣品：
1. 甲硝唑
2. 3-羥基苯甲酸
3. 苯酚
4. 苯甲醇
5. 咖啡茵
6. 水楊酸
7. 喹喔啉
8. 苯甲酸
9. 奎寧
10. 非那西丁
11. 1,4-二硝基苯
12. 1,3,5-三硝基苯
13. 呋塞米
14. 1,3,5 -三甲氧基苯
15. 吡羅昔康
16. 卡維地洛
17. 苯甲酸乙酯
18. 去甲替林

C18-AR相的疏水性更大，這可以為色譜峰對(duì)（13,14）和（15,17）提供更多的保留值和更佳的選擇性。還要注意C18-AR與苯基相的洗脫順序有很多變化。

圖3給出了鍵合相選擇能力的另一實(shí)例。

一個(gè)分離是用C18鍵合相的UHPLC色譜柱完成，另一個(gè)分離是用C18-PFP鍵合相的UHPLC色譜柱完成。

C18-PFP鍵合相提供的額外分離機(jī)制，使得總體分離效果更佳出色。

圖 3：ACE Excel可以獲得zhuo越的分離度和峰形：藥物及其相關(guān)物質(zhì)的UHPLC結(jié)果

條件
色譜柱尺寸：50 x 2.1mm
流動(dòng)相：

A = 5mM甲酸（溶于水中）
B = 5mM甲酸（溶于甲醇中）
梯度：5分鐘內(nèi)從3至B
流速：0.6 mL/min
溫度：40 ℃
檢測(cè)：UV 254 nm

樣品
1. 對(duì)乙酰氨基酚
2. 氫氯噻嗪
3. 甲基苯基亞砜
4. 甲基苯砜

在C18 UHPLC色譜柱和C18-PFP色譜柱上同樣快速地產(chǎn)生色譜圖。

然而，C18-PFP色譜柱可以為色譜峰對(duì)（13,14）和（15,17）提供更佳的選擇性，因此能夠提供優(yōu)越的總體分離性能。