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  十幾年x 2017-11-24 15:46:40

  亞硫酸氫鈉測序法(bisulfite genomic sequencing) 直接測序法是建立在MSP基礎(chǔ)上進(jìn)一步深入研究CpG島各個位點甲基化情況的方法。重亞硫酸鹽使DNA中未發(fā)生甲基化的胞嘧啶脫氨基轉(zhuǎn)變成尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶保持不變，行PCR擴(kuò)增(引物設(shè)計時盡量避免有CpG，以免受甲基化因素的影響)所需片段，則尿嘧啶全部轉(zhuǎn)化成胸腺嘧啶。Z后，對PCR產(chǎn)物進(jìn)行測序，并且與未經(jīng)處理的序列比較，判斷是否CpG位點發(fā)生甲基化。此方法一種可靠性及精確度很高的方法，能明確目的片段中每一個CpG位點的甲基化狀態(tài)。在尋找有意義的關(guān)鍵性CpG位點上，有其他方法無法比擬的優(yōu)點。測序法以CpG島兩側(cè)不含CpG點的一段序列為引物配對區(qū)，所以能夠同時擴(kuò)增出甲基化和非甲基化靶序列。它的不足是耗費時間和耗資過多，至少要測序10個以上的克隆才能獲得可靠數(shù)據(jù)，需要大量的克隆及質(zhì)粒提取測序，過程較為繁瑣、昂貴。 diyi部分 基因組DNA的提取。 這一步?jīng)]有懸念，完全可以購買供細(xì)胞或組織使用的DNA提取試劑盒，如果實驗室條件成熟，自己配試劑提取完全可以。DNA比較穩(wěn)定，只要在操作中不要使用暴力，提出的基因組DNA應(yīng)該是完整的。 此步ZD在于DNA的純度，即減少或避免RNA、蛋白的污染很重要。因此在提取過程中需使用蛋白酶K及RNA酶以去除兩者。 使用兩者的細(xì)節(jié)： 1：蛋白酶K可以使用滅菌雙蒸水配制成20mg/ml； 2：RNA酶必須要配制成不含DNA酶的RNA酶，即在購買市售RNA酶后進(jìn)行再處理，配制成10mg/ml。否則可能的后果是不僅沒有RNA，連DNA也被消化了。兩者均于-20度保存。 驗證提取DNA的純度的方法有二： 1：紫外分光光度計計算OD比值； 2：1%-1.5%的瓊脂糖凝膠電泳。 我傾向于第二種方法，這種方法完全可以明確所提基因組DNA的純度，并根據(jù)Marker的上樣量估計其濃度，以用于下一步的修飾。 第二部分 亞硫酸氫鈉修飾基因組DNA 如不特別指出，所用雙蒸水（DDW）均經(jīng)高壓蒸汽滅菌。 1：將約2ugDNA于1.5mlEP管中使用DDW稀釋至50ul； 2：加5.5ul新鮮配制的3M NaOH； 3： 42℃水浴30min； 水浴期間配制： 4：10mM對苯二酚（氫醌），加30ul至上述水浴后混合液中；（溶液變成淡黃色） 5： 3.6M亞硫酸氫鈉（Sigma，S9000），配制方法：1.88g亞硫酸氫鈉使用DDW稀釋，并以3M NaOH滴定溶液至PH 5.0，Z終體積為5ml。這么大濃度的亞硫酸氫鈉很難溶，但加入NaOH后會慢慢溶解，需要有耐心。PH一定要準(zhǔn)確為5.0。加520ul至上述水浴后溶液中。 6：EP管外裹以鋁箔紙，避光，輕柔顛倒混勻溶液。 7：加200 ul 石蠟油，防止水分蒸發(fā)，限制氧化。 8：50℃避光水浴16h。 一般此步在4pm開始做，熟練的話不到5pm即可完成，水浴16h正好至次日8am以后收，時間上很合適。 這一步細(xì)節(jié)： 1：基因組DNA的量不需十分精確，寧多勿少，因為在以后純化回收步驟中會有丟失，且此方法修飾Z多可至4ug。 2：所有試劑均須新鮮配制，所以配液的技術(shù)要過關(guān)，既要快，又要精確。 3：亞硫酸氫鈉溶液呈強(qiáng)酸性，一定用堿將PH調(diào)制5.0，否則PH不合適會影響后續(xù)純化吸收。 4：水浴Z好達(dá)16小時，雖可以短至8小時，但后者修飾會有不完全。 第三部分 修飾后DNA純化回收 EP管如無特別說明均為高壓蒸汽滅菌的。 1. 將移液器槍頭伸入石蠟油層下，先輕輕加壓使其中一小段石蠟油排出，然后吸取混合液至一潔凈1.5mlEP管中。 2：以下使用Promega Wizard Cleanup DNA純化回收系統(tǒng)（Promega，A7280） 1）70℃水浴預(yù)熱DDW；配制80%異丙醇； 2）加1ml Promega’s Wizard DNA Clean-up resin，輕柔顛倒混勻，使DNA充分與樹脂結(jié)合； 3）由于該試劑盒中僅配備針筒沒有針?biāo)ǎ绻姓婵肇?fù)壓吸引器，使用起來很方便；如果沒有，需要自備3ml-5ml注射器。將注射器針筒與試劑盒提供的回收小柱緊密連接后，將上述混合物用移液器移至針筒內(nèi)，用2ml以上的EP管放置小柱下接收廢液。加針?biāo)?，輕輕加壓，將液體擠出，此時可見小柱內(nèi)有白色的樹脂沉積。 4）將注射器與小柱分離后拔出針?biāo)?，再將針筒與小柱連接，向針筒內(nèi)加入2ml 80％的異丙醇，插入針?biāo)ǎp輕加壓，將異丙醇擠出。此為洗滌步驟。 5）將注射器與小柱分離，將小柱置于潔凈1.5ml潔凈EP管上，離心12000rpm，2min，以甩去殘余異丙醇成分，使樹脂干燥。此時，修飾后DNA處于與樹脂結(jié)合狀態(tài)。 6）將小柱取下置于另一潔凈1.5mlEP管上，移液器加50ul預(yù)熱好的DDW，室溫放置5min。 7）離心12000rpm，20s，此為洗脫步驟，此時EP管內(nèi)液體即為洗脫的修飾后DNA溶液，終體積為50ul。 3：加5.5ul 新鮮配制的3M NaOH，室溫放置15min。 4：加33ul 10M乙酸銨，以中和NaOH，使溶液PH于7.0左右。 5：加4ul 10mg/ml糖原，此作為沉淀指示劑，因為其與乙醇混合后可產(chǎn)生沉淀，便于以后離心后辨別回收物的位置，以防在吸取殘余乙醇時將回收物吸走。其實，加入這些糖原究竟能起多大作用，不好說。不過有國產(chǎn)糖原賣，包裝不大，也很便宜，買來一用，算嚴(yán)格遵守文獻(xiàn)的步驟吧。 6：加270ul 冰無水乙醇，置于-20度，過夜沉淀。有人為沉淀Z短可至2小時，但我認(rèn)為時間長些可能會更好。并且做到此步驟時，一般會到中午，如果樣本多的話要到下午，不妨放置過夜，日程可以輕松些，順便做些其他試驗。如果想當(dāng)天做完，沒有問題，但我認(rèn)為Z好多沉淀些時候，至少6小時吧（這是經(jīng)驗，我做過Z少6小時，也是可以的，再短就不敢發(fā)表意見了） 7：4度，12000rpm離心，30min，倒去上清液，收集沉淀。不必吸凈。 8：加500ul 70%乙醇，不要將沉淀吹打起來，只要把乙醇加上即可。輕柔傾斜EP管，旋轉(zhuǎn)一圈，再次離心，4度12000rpm，5min。離心后倒掉上清，再加同量乙醇，同樣再做一遍。此為洗滌步驟，共2次。 9：倒掉上清，并常溫簡短離心后，將附壁乙醇離至EP管底，移液器小心將殘余液體吸凈，室溫干燥5min，或沉淀由不透明變?yōu)榘胪该骰蛲该鲿r，加入20ul- 30ulDDW，溶解沉淀。至此，已完成了修飾后DNA的純化回收，所得為修飾后DNA溶液，可用于此后的進(jìn)一步實驗。 10：-20℃保存DNA溶液。 此步細(xì)節(jié)： 1：在使用注射器時，一定要用力均勻且輕，如使用暴力，會將小柱內(nèi)的薄膜擠破，失去作用。 2：乙酸銨、糖原不需新鮮配制，糖原配好后放在-20度保存，乙酸銨室溫即可，因為這樣濃度的乙酸銨非常難溶，一旦放在4度，取出用時也會有很多溶質(zhì)析出。 3：異丙醇、70%乙醇都不需要新鮮配制，但如果用量大，現(xiàn)場配也很方便。 此步關(guān)鍵是在樹脂與DNA的結(jié)合上，這就再次強(qiáng)調(diào)第二部分調(diào)亞硫酸鈉PH值得重要性。因為樹脂與DNA結(jié)合需要有一個適當(dāng)?shù)腜H，如前一步?jīng)]做好，此步樹脂不能與DNA很好結(jié)合，將會帶來災(zāi)難性后果，即DNA隨著液體被擠出了，洗脫時實際已沒有任何DNA了。 第四部分 修飾后DNA用于PCR 這一步也沒有懸念。我主要談一下這里面的幾個比較棘手的問題： 1：引物問題：我感覺自己設(shè)計引物有相當(dāng)?shù)碾y度，我曾設(shè)計過幾對引物，并且試驗了一下，但以失敗告終。如果時間充裕、作的又是比較新的基因文獻(xiàn)不多，自己設(shè)計引物沒有問題。如果不是這樣，還是參考文獻(xiàn)更好些。首先查閱SCI分值高的文獻(xiàn)，然后是實驗室的文獻(xiàn)，如果國內(nèi)有做的，更好了，可以直接聯(lián)系咨詢。查到序列后，一定要和Genbank中的序列進(jìn)行比對，防止有印刷錯誤造成的個別堿基的差別。然后再到google上搜一下，看用的人多否，體系條件是否一樣。用的人多、體系條件一樣，表明可重復(fù)性比較強(qiáng)。我也是按此行事，算比較順利。 2：Taq酶問題：有文獻(xiàn)用高保真的金牌 Taq（Platinum），但我感覺只要體系正確、變性退火等條件合適，一般的熱啟動酶是可以的。我開始使用的是Takara的LA Taq，很好用，配有10x含mg++的LA緩沖液。有時候用沒了，暫時以Takara 的普通Taq酶也可以。如何選擇，可以根據(jù)自己的情況。初作者還是用好一點的酶。 3：PCR的條件：變性一般都選擇95度，3min。其余我感覺還是根據(jù)文獻(xiàn)，退火可以根據(jù)你的引物的退火溫度在小范圍內(nèi)嘗試。一般和文獻(xiàn)報道差別不大。只是擴(kuò)增片斷特異性的問題。建議根據(jù)文獻(xiàn)。 4：做PCR的EP管Z好選擇進(jìn)口的，壁薄且厚度均勻，這可以保證溫度的迅速變化可以及時傳遞給管內(nèi)的反應(yīng)液，使體系真正在所設(shè)定的溫度下運行。 5：PCR儀：如果在某一個儀器上作出來了，Z好一直用此儀器繼續(xù)。不同的儀器“脾氣”也不一樣，但EP管必要和儀器內(nèi)的插孔緊密結(jié)合方好，留有空隙，我認(rèn)為會影響溫度的傳遞。 這一部分有些啰嗦，只是個人一些不成熟經(jīng)驗。有疑問處，請大家指出，交流。今天先到這里，現(xiàn)寫一些內(nèi)容，比較費勁，總是不能一揮而就。望見諒。歇息一會準(zhǔn)備寫Z后藍(lán)白斑篩選克隆這一部分。 第五部分 PCR產(chǎn)物的凝膠回收 這一步比較簡單，可以購買一個凝膠PCR產(chǎn)物回收試劑盒，國產(chǎn)的就很好、價格也合理，比如TIANGEN的產(chǎn)品（用過）。把切下來的膠按說明書操作即可。 幾個細(xì)節(jié)： 1：PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，要使用新配的電泳液。凝膠濃度1%-2%均可。 2：凝膠DNA回收時在300nm紫外燈下觀察條帶位置，切取目的片斷所在位置的凝膠，盡量小，保證特異性。 3：紫外照射時間不能過長，否則對DNA有損傷。 4：回收后的DNA如不馬上用就儲存于-20度，在數(shù)月內(nèi)是很穩(wěn)定的。 第六部分 PCR產(chǎn)物與T載體的連接和轉(zhuǎn)化、藍(lán)白斑篩選 1：連接T載體（本實驗使用的是Promega的試劑盒） 15ul體系 T-easy 1ul Ligase 1ul 2xbuffer 7.5ul DNA 5.5ul 4度，過夜。 2：連接產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化 1）-70度冰箱內(nèi)取出感受態(tài)細(xì)菌，融化后置于冰上； 2）連接產(chǎn)物15ul 全部加入，至于冰上30分鐘； 3）42度， 90秒鐘； 4）冰上2分鐘； 5）800ul LB培養(yǎng)基； 6）280rpm，37度，搖床45分鐘（將管放水平了搖，保證菌液搖勻）； 7）8000rpm，1分鐘；在超凈臺內(nèi)去上清，留100-150ul； 8）涂板：37度孵箱過夜；（板為含有氨芐青霉素的固體LB培養(yǎng)基） 先涂：X-gar 35ul IPTG 25ul 后涂：混懸液 過夜后可見板上長出很多藍(lán)色或白色斑點，取白色斑點，尤其是藍(lán)色斑點周圍的白色斑點，此處自聯(lián)率較低。 3：取白斑，劃種于新板上 新板：先涂：X-gar 35ul IPTG 25ul 然后于板底劃出分區(qū)，進(jìn)行標(biāo)記。根據(jù)需要，一般一板作50個克隆沒有問題。 針頭挑白斑劃2道于板上相應(yīng)區(qū)域內(nèi)。 37度，孵箱過夜。 4：聯(lián)系測序公司送測序。一般一個克隆在35-45元。 這一部分的細(xì)節(jié)： 1：涂板要均勻，保證Xgar和IPTG均勻分布在板面上； 2：不要讓藍(lán)白斑長得太滿，否則選取克隆時容易一下挑2個。

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