雜交瘤技術(shù)又稱細(xì)胞融合技術(shù)，是將兩個(gè)或多個(gè)細(xì)胞融合成一個(gè)。 融合后形成的雜交瘤細(xì)胞承襲了兩親本細(xì)胞的特征。 自發(fā)的細(xì)胞融合很少發(fā)生，當(dāng)加入一種融合劑，如：聚乙二醇（常用）、仙臺(tái)病毒或溶血卵磷脂后，兩種細(xì)胞就可發(fā)生融合。 首先是質(zhì)膜互相融合，形成具有兩個(gè)或多個(gè)核的異核體，細(xì)胞進(jìn)一步分裂時(shí)，核互相融合，形成了雜交細(xì)胞。

雜交瘤技術(shù)優(yōu)缺點(diǎn)：

優(yōu)點(diǎn)：與傳統(tǒng)的免疫動(dòng)物方法制備抗體相比，利用雜交瘤技術(shù)可以制備出高純度的單抗，并且可以進(jìn)行單克隆抗體的大量生產(chǎn)。

缺點(diǎn)：a.操作步驟繁瑣。b.利用雜交瘤技術(shù)生產(chǎn)出的單克隆抗體多為鼠源性，而鼠源性抗體在應(yīng)用中有諸多問題，例如被人類免疫系統(tǒng)所識(shí)別，產(chǎn)生人抗鼠抗體( HAMA）反應(yīng)、在人體循環(huán)系統(tǒng)中很快被清除等。

雜交瘤技術(shù)應(yīng)用：

①診斷應(yīng)用：?jiǎn)慰寺】贵w在疾病診斷中發(fā)揮了重要作用，其優(yōu)點(diǎn)在于診斷準(zhǔn)確且無交叉反應(yīng)，例如在乙型肝炎及潛伏的乙型肝炎病毒的診斷中，單克隆抗體能顯著減少假陰性的漏診。

②治-療載體：?jiǎn)慰寺】贵w也可作為治-療疾病的載體。通過與抗腫瘤藥物結(jié)合，單克隆抗體能在體內(nèi)選擇性集中攻擊腫瘤細(xì)胞，具有靶向性，從而減少對(duì)正常組織的損傷并減輕抗-癌藥物的副作用。因此，載藥單克隆抗體被譽(yù)為“生物導(dǎo)-彈”。

③異種蛋白質(zhì)問題：目前大多數(shù)單克隆抗體為鼠-鼠型，對(duì)于人體來說屬于異種蛋白質(zhì)，容易引起排異反應(yīng)，限制了其在治-療中的應(yīng)用。

④人-人型單克隆抗體的研究：為了解決排異問題，研究者正在努力研發(fā)人-人型單克隆抗體，以利于其在治-療中的廣泛應(yīng)用。

雜交瘤技術(shù)常見問題解析：

①電融合和PEG融合的區(qū)別？

PEG化學(xué)融合是利用聚乙二醇分子能夠改變細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)的特性來實(shí)現(xiàn)細(xì)胞融合的過程。聚乙二醇可以使兩個(gè)細(xì)胞接觸點(diǎn)質(zhì)膜的脂質(zhì)分子發(fā)生疏散和重組，兩個(gè)細(xì)胞接觸部位的質(zhì)膜由于相互親和以及彼此的表面張力作用，從而發(fā)生細(xì)胞融合。電融合則是先通過高頻交流電壓，使細(xì)胞成串珠狀排列，實(shí)現(xiàn)點(diǎn)接觸；然后施加方波脈沖，擊穿兩個(gè)細(xì)胞接觸部位的質(zhì)膜，質(zhì)膜脂質(zhì)分子發(fā)生重組，同時(shí)由于細(xì)胞表面張力作用，完成細(xì)胞融合。電融合法比PEG融合法有明顯的優(yōu)點(diǎn)：細(xì)胞融合率高，有利于雜交瘤的篩選；電脈沖擊穿對(duì)細(xì)胞的損傷小，有利于融合后細(xì)胞的生長(zhǎng)增殖；可直接觀察融合過程；便于有目的地控制選擇融合條件。

②為什么要推薦進(jìn)行2~3輪有限稀釋獲得穩(wěn)定的雜交瘤細(xì)胞株？

陽性單克隆細(xì)胞的獲得通常進(jìn)行至少2輪有限稀釋，原因主要考慮兩點(diǎn)。第一，有限稀釋過程中，大多數(shù)是通過實(shí)驗(yàn)者在顯微鏡下觀察細(xì)胞團(tuán)狀態(tài)來判定是否是單克隆，存在一定的主觀經(jīng)驗(yàn)值，至少進(jìn)行兩輪有限稀釋可以增加判斷的準(zhǔn)確性；第二，雜交瘤細(xì)胞由兩個(gè)細(xì)胞融合而成，存在基因的不穩(wěn)定性，連續(xù)2輪有限稀釋，客觀上增加了篩選中細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)間，有利于淘汰不穩(wěn)定的雜交瘤細(xì)胞株。

③為什么要使用核酸免疫？

重組蛋白由于免疫靶向明確、劑量可控等優(yōu)勢(shì)，通常作為動(dòng)物免疫階段的首-選免疫原。但有些重組蛋白因?yàn)楸磉_(dá)純化困難，很難大量獲得并用于動(dòng)物免疫；另外，重組蛋白與天然樣本之間存在或多少的結(jié)構(gòu)差異。而核酸免疫，跳過了蛋白表達(dá)純化的過程，成功避開了蛋白生產(chǎn)的難題，通過核酸體內(nèi)表達(dá)的蛋白結(jié)構(gòu)也更加接近天然蛋白，故而可以作為重組蛋白免疫的有效補(bǔ)充手段。但核酸免疫的免疫劑量很難判斷，整體免疫效價(jià)也會(huì)普遍低于蛋白和多肽免疫。

④除弗氏佐劑之外，免疫佐劑還有哪些？

免疫佐劑是指那些同抗原一起或預(yù)先注入機(jī)體內(nèi)能增強(qiáng)機(jī)體對(duì)抗原的免疫應(yīng)答能力或改變免疫應(yīng)答類型的輔助物質(zhì)。佐劑的免疫生物學(xué)作用是增強(qiáng)免疫原性、增強(qiáng)抗體的滴度、改變抗體產(chǎn)生的類型、引起或增強(qiáng)遲發(fā)超敏反應(yīng)等。除經(jīng)典的弗氏佐劑外，各類不同功能的佐劑也層出不窮，比較常見的有：1）無機(jī)佐劑，如磷酸鋁佐劑、氫氧化鋁佐劑；2）生物類佐劑，如以細(xì)菌胞壁或產(chǎn)物為主要組成的佐劑；3）具有佐劑活性的細(xì)胞因子類，如GSF、IL1、IL2、IFN -γ等；4）人工合成佐劑，如cpG等。

⑤雜交瘤融合后主克隆接種96孔細(xì)胞培養(yǎng)板數(shù)量通常是多少？

融合后的主克隆細(xì)胞接種96孔細(xì)胞培養(yǎng)板的數(shù)量與融合效率和脾細(xì)胞多少有密切關(guān)系。PEG化學(xué)融合后的主克隆，通常一只小鼠的脾細(xì)胞可以接種8-15塊96孔細(xì)胞培養(yǎng)板；電融合因?yàn)槿诤闲蚀蟠筇岣?，通常一只小鼠的脾?xì)胞可以接種30~50塊96孔細(xì)胞培養(yǎng)板。

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前言

免疫熒光技術(shù)是在免疫學(xué)、生物化學(xué)和顯微鏡技術(shù)的基礎(chǔ)上建立起來的一項(xiàng)技術(shù)，它是將不影響抗原抗體活性的熒光色素標(biāo)記在抗體（或抗原）上，與其相應(yīng)的抗原（或抗體）結(jié)合后，在熒光顯微鏡下呈現(xiàn)一種特異性熒光反應(yīng)。利用熒光顯微鏡可以看見熒光所在的細(xì)胞或組織，從而確定抗原或抗體的性質(zhì)和定位，以及利用定量技術(shù)（比如流式細(xì)胞儀）測(cè)定含量。

直接法

將標(biāo)記的特異性熒光抗體，直接加在抗原標(biāo)本上，經(jīng)一定的溫度和時(shí)間的染色，用水洗去未參加反應(yīng)的多余熒光抗體，室溫下干燥后封片、鏡檢。

間接法

如檢查未知抗原，先用已知未標(biāo)記的特異抗體（第一抗體）與抗原標(biāo)本進(jìn)行反應(yīng)，用水洗去未反應(yīng)的抗體，再用標(biāo)記的抗抗體（第二抗體）與抗原標(biāo)本反應(yīng)，使之形成抗體—抗原—抗體復(fù)合物，再用水洗去未反應(yīng)的標(biāo)記抗體，干燥、封片后鏡檢。如果檢查未知抗體，則表明抗原標(biāo)本是已知的，待檢血清為第一抗體，其它步驟的抗原檢查相同。

標(biāo)記的抗抗體是抗球蛋白抗體，同于血清球蛋白有種的特異性，如免疫抗雞血清球蛋白只對(duì)雞的球蛋白發(fā)生反應(yīng)，因此，制備標(biāo)記抗體適用于任何抗原的診斷。

一、實(shí)驗(yàn)步驟

免疫熒光實(shí)驗(yàn)的主要步驟包括 樣片制備、固定及通透（或稱為透化）、封閉、抗體孵育、封片及熒光檢測(cè)等。

1、 樣品準(zhǔn)備

對(duì)于單層生長(zhǎng)細(xì)胞，在傳代培養(yǎng)時(shí)，將細(xì)胞接種到預(yù)先放置有處理過（70%乙醇中浸泡）的蓋玻片的培養(yǎng)皿中，待細(xì)胞接近長(zhǎng)成單層后取出蓋玻片即可，操作過程要小心，防止細(xì)胞脫片。

對(duì)于懸浮生長(zhǎng)細(xì)胞，有兩種方式，一種是取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)細(xì)胞，制備細(xì)胞片或直接制備細(xì)胞涂片，把細(xì)胞片浸入封閉液中固定，封閉后滴加一抗和二抗孵育；另一種是先在懸浮液中進(jìn)行固定和染色，離心洗脫后，用移液管移至盒式玻片進(jìn)行后續(xù)抗體孵育。

對(duì)于冰凍切片制備，建議用新鮮組織，否則組織細(xì)胞內(nèi)部結(jié)構(gòu)破壞，易使抗原彌散。組織一定要冷凍適度，切片時(shí)選用干凈鋒利的刀片，防止裂片和脫片。

對(duì)于石蠟切片的制備，要先進(jìn)行脫蠟和抗原修復(fù)的處理。

2、固定

做好切片并風(fēng)干后立即用合適的固定液（固定液包括有機(jī)溶劑和交聯(lián)劑，其選擇取決于抗原的性質(zhì)及所用抗體的特性）進(jìn)行固定，尤其要較長(zhǎng)時(shí)間保存的白片，一定要及時(shí)固定和適當(dāng)保存。

固定時(shí)間則取決于固定組織切片的大小和類型，對(duì)大多數(shù)組織，18-24h即可，而細(xì)胞的固定時(shí)間較短。

3、通透

針對(duì)胞內(nèi)抗原，使用0.5% Triton X-100或丙酮等通透劑進(jìn)行通透，這一步的目的是使抗體進(jìn)入胞內(nèi)。

4、封閉

為防止內(nèi)源性非特異性蛋白抗原的結(jié)合，需要在一抗孵育前先用封閉液（一般包括與二抗同一來源的血清、BSA或者羊血清）封閉，減弱背景著色。封閉開始后，要注意樣品的保濕，避免樣品干燥，否則極易產(chǎn)生較高的背景。

5、一抗孵育

一抗孵育溫度一般分為：4℃、室溫、37℃，其中4℃效果更佳；孵育時(shí)間與溫度、抗體濃度有關(guān)，一般37℃孵育1-2h，4℃過夜（從冰箱拿出后37℃復(fù)溫45min）。具體條件還要根據(jù)樣品、稀釋液等條件進(jìn)行摸索嘗試。

6、熒光二抗孵育

熒光二抗孵育一般在室溫或37℃孵育30min-1h，該過程必須在避光環(huán)境下進(jìn)行，防止熒光淬滅。熒光素標(biāo)記的二抗隨著保存時(shí)間的延長(zhǎng)，可能會(huì)有大量的游離熒光素殘留，需要注意配制時(shí)采用小包裝并進(jìn)行適當(dāng)?shù)碾x心。

7、復(fù)染

一般采用DAPI進(jìn)行復(fù)染，目的是形成細(xì)胞輪廓，從而對(duì)目標(biāo)蛋白進(jìn)行定位。

8、封片

為了長(zhǎng)期保存，我們需要對(duì)樣本進(jìn)行封片，用吸水紙吸干爬片上的液體，一般用緩沖甘油等或?qū)ｉT的抗熒光淬滅的封片液。

9、 熒光觀察

有條件的話立即用熒光顯微鏡觀察拍照，若不能及時(shí)拍照，也要做好封片和封固，保持避光和濕度。熒光顯微鏡的成像能力對(duì)最終的結(jié)果也會(huì)造成很大的影響，好的熒光顯微鏡能夠最大限度地收集熒光信號(hào)，并呈現(xiàn)高分辨率的圖片，使細(xì)節(jié)更清楚，更易得到一張效果極佳的結(jié)果圖。

注意：

切片清洗：為了防止一抗、二抗等試劑殘留而引起非特異性染色，所以適當(dāng)?shù)丶訌?qiáng)清洗(延長(zhǎng)時(shí)間和增多次數(shù))尤為重要，一般在一抗孵育前的清洗是3min*3次，而一抗孵育后的清洗均為5次*5min。

(1)單獨(dú)沖洗，防止交叉反應(yīng)造成污染；

(2)溫柔沖洗，防止切片的脫落。可使用浸洗方式；

(3)沖洗的時(shí)間要足夠，才能徹底洗去結(jié)合的物質(zhì)；

(4)PBS的PH和離子強(qiáng)度的使用和要求（建議PH在7.4-7.6，濃度是0.01M；中性及弱堿性條件有利于免疫復(fù)合物的形成，而酸性條件則有利于分解；低離子強(qiáng)度有利于免疫復(fù)合物的形成，而高離子強(qiáng)度則有利于分解）。

根據(jù)上述步驟完成免疫熒光實(shí)驗(yàn)后，就需要進(jìn)行熒光顯微成像，得到我們想要的結(jié)果。選擇一款操作簡(jiǎn)單、成像清晰、效果卓越的熒光顯微鏡進(jìn)行觀察拍照，才能輕松得到更為理想的結(jié)果圖，達(dá)到事半功倍的效果。

Echo Revolve正倒置一體熒光顯微鏡

Echo Revolve正倒置一體熒光顯微鏡作為一款電動(dòng)化、智能化的顯微鏡，具有以下優(yōu)勢(shì)：

? 正倒置一體快速切換：切片、細(xì)胞觀察隨心切換，無懼任何耗材；

? DHR數(shù)字降噪功能：極大地降低了背景噪音和熒光干擾，提高圖像銳度，加深細(xì)節(jié)，得到分辨率更高的圖片；

? 強(qiáng)大的Z-Stacking功能：通過高精度電動(dòng)化Z軸層掃來擴(kuò)大景深，解決厚樣本觀察問題，提高圖像分辨率；

? 500MP單色相機(jī)：能夠采集更多熒光信號(hào)，助力低熒光強(qiáng)度樣本觀察；

? 多通道熒光自動(dòng)拍攝疊加功能：可自動(dòng)進(jìn)行多通道成像的疊加，個(gè)性化選擇查看/保存各通道的組合圖像。

倒置熒光顯微鏡下的免疫熒光細(xì)胞：探索微觀世界的奧秘

顯微鏡觀察免疫熒光細(xì)胞是一種重要的實(shí)驗(yàn)方法，用于研究細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)、核酸等成分的表達(dá)、功能和相互作用，目前，免疫熒光顯微鏡已經(jīng)成為生物學(xué)研究中不可或缺的工具之一。

在倒置熒光顯微鏡觀察細(xì)胞時(shí)，需要選擇合適的顯微鏡參數(shù)，以確保觀察的準(zhǔn)確性和穩(wěn)定性。例如，光源的種類、顯微鏡的分辨率、物鏡放大倍數(shù)和熒光通過率等因素。此外，在進(jìn)行免疫熒光顯微鏡觀察細(xì)胞時(shí)，需要選擇合適的熒光強(qiáng)度和熒光顏色，以避免對(duì)觀察結(jié)果的干擾。

倒置熒光顯微鏡MF52-N采用無限遠(yuǎn)光學(xué)設(shè)計(jì)和數(shù)顯LED熒光模塊，光路經(jīng)過深度優(yōu)化，能提供簡(jiǎn)單易用的熒光激發(fā)和高質(zhì)量的相襯、熒光和明場(chǎng)成像，可選雙光路、一體供電、人走燈滅，廣泛用于細(xì)胞培養(yǎng)、生物制藥、醫(yī)療檢測(cè)等領(lǐng)域。

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